丁苯酞對血管性癡呆大鼠認知功能及海馬區Aβ表達的影響

竇 雯 杜業亮 劉 英 李增芬

1）濰坊醫學院 濰坊 261042 2）山東濰坊市腦科醫院神經內科 濰坊 261021

隨著我國進入老齡化社會，腦血管病人逐年增加，血管性癡呆血管性癡呆（VaD）人數也在不斷增長，導致患者記憶、認知功能障礙，給家庭和社會帶來沉重的負擔。VaD是由血管性因素導致腦組織損害引起的癡呆，為老年期癡呆中僅次于阿爾茨海默病的第二位常見的類型［1］。探討血管性癡呆的發病機制及防治至關重要。目前研究認為血管性癡呆與Aβ在腦組織中沉積關系密切。本實驗通過觀察丁苯酞（NBP）對血管性癡呆大鼠認知功能及海馬區Aβ表達的影響，探討NBP對血管性癡呆的作用機制及其防治，為臨床應用提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1實驗動物健康雄性SD大鼠40只，購自濟寧市任城區魯原動物飼養經營部，體質量250～300g，飼養溫度18～25℃，濕度60%～70%，普通飼料喂養，自由攝食與飲水，自然光照，大鼠術前12h禁食不禁水。動物分組及干預：通過Morris水迷宮測試篩選出健康雄性SD大鼠24只，隨機分為模型組、對照組、丁苯酞低劑量組、丁苯酞高劑量組4每組再按取材時間不同分為4周組和6周組，每組5只。

1.2藥物及試劑丁苯酞（石藥集團提供），兔抗鼠Aβ抗體（北京博奧森生物技術有限公司），二抗及DAB顯色劑（北京中杉金橋生物技術有限公司），10%水合氯醛，4%多聚甲醛。

1.3模型制備采用Olsson方法結扎雙側勁總動脈建立動物模型，假手術組分離但不結扎勁總動脈。大鼠術前12h禁食，不禁水。10%水合氯醛4mL／kg腹腔麻醉，動物仰臥固定，頸前正中切口，鈍性分離暴露雙側頸總動脈，埋線結扎，縫合切口。對照組僅做頸前切口，鈍性分離雙側頸總動脈，不行結扎。術后每日肌內注射青霉素，連續3d。

1.4入選標準癡呆標準：以對照組大鼠逃避潛伏期的均值為參考值，計算每只大鼠的平均逃避潛伏期與參考值之差占該鼠的平均逃避潛伏期時間的比例，該值＞20%定為癡呆鼠。將符合癡呆標準的大鼠隨機納入實驗分組。

1.5給藥方法從造模后1個月開始灌胃治療，丁苯酞低劑量組、丁苯酞高劑量組分別灌服丁苯酞60mg／（kg·d）、120mg／（kg·d），丁苯酞用花生油稀釋至2mL，模型組、對照組給以等量花生油灌胃。

1.6行為學檢測采用 Morris水迷宮實驗裝置檢測大鼠行為學，以逃避潛伏期代表大鼠認知能力，逃避潛伏期越短，認知能力越強。

1.7標本采集與組織學檢查分別于連續灌胃4周和6周后取材。將各組大鼠分別用10%水合氯醛腹腔過量麻醉后，暴露心臟，先用37℃生理鹽水250mL經升主動脈快速沖洗去除紅細胞，后用4%多聚甲醛（pH值7.4）約500mL先快后慢灌注，至動物呈僵硬狀態，后斷頭取腦，4%多聚甲醛后固定24～48h，石蠟包埋切片，取海馬區腦組織連續4μm厚切片，進行免疫組化染色。在40×10倍光鏡下隨機選擇5個不重疊視野，做免疫反應陽性細胞數計數，結果取5個視野的平均值。

1.8圖像分析采用IPP6.0分析計數免疫組化陽性細胞數（胞漿著色呈棕黃色或棕褐色，部分細胞胞核著色）。

1.9統計學處理應用SPSS統計軟件，檢測結果用（s）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義，2組間比較采用SNK法。

2 結果

2.1各組大鼠水迷宮實驗學習、記憶成績比較在術后各時間點，經Morris水迷宮訓練的模型組大鼠逃避潛伏期較對照組明顯延長，認知功能下降（P＜0.05）；經丁苯酞治療后發現，丁苯酞治療組的逃避潛伏期較模型組明顯縮短（P＜0.05），說明丁苯酞可以改善血管性癡呆大鼠的認知功能。見表1。

表1 各組大鼠平均逃避潛伏期及跨平臺次數比較（s，s）

表1 各組大鼠平均逃避潛伏期及跨平臺次數比較（s，s）

與模型組比較，▲P＜0.05；與低劑量組比較，★P＜0.05

組別 n 逃避潛伏期（4周）逃避潛伏期（6周）對照組▲★

2.2各組大鼠海馬Aβ陽性細胞表達比較各時間點可見Aβ在假手術組海馬區有少量表達。模型組及治療組海馬區Aβ陽性細胞數目增多（P＜0.05）。與模型組相比，治療組海馬區Aβ陽性細胞數目降低（P＜0.05），其中高劑量丁苯酞組較低劑量丁苯酞組Aβ表達減少（P＜0.05）。且隨用藥時間的延長，陽性細胞數也呈下降趨勢（P＜0.05）。見表2。

表2 不同時間點各組大鼠腦組織中Aβ的免疫陽性細胞數比較（s，s）

表2 不同時間點各組大鼠腦組織中Aβ的免疫陽性細胞數比較（s，s）

與模型組比較，▲P＜0.05；與低劑量組比較，★P＜0.05

組別 4周 6周對照組27.00±1.87 28.20±1.92模型組 68.4.00±3.85 72.80±5.54丁苯酞低劑量組 53.40±1.82▲ 57.00±1.58▲丁苯酞高劑量組 41.80±1.64▲★ 44.60±2.30▲★

3 討論

本實驗大鼠的逃避潛伏期變化提示模型組大鼠發生認知功能障礙，不同劑量丁苯酞治療后大鼠認知功能有所改善，且高劑量組較低劑量組改善明顯。本實驗通過免疫組化染色觀察Aβ在腦組織尤其在海馬中的表達變化，模型組海馬區Aβ陽性細胞數量隨著缺血時間延長而逐漸增長，應用丁苯酞后發現陽性細胞數量降低，且高劑量組較低劑量組下降明顯。

丁苯酞是從芹菜籽中提取出來的左旋體，后經人工合成為消旋體，可阻斷缺血性腦損傷的多個病理環節，具有較強的抗腦缺血作用。海馬是參與空間學習記憶的重要結構，對缺血缺氧損傷十分敏感。2VO模型慢性腦缺血時由腦部低灌注引起的海馬神經元損傷，通常被認為是VD進程中學習記憶能力障礙的病理基礎［2］?，F代研究發現，缺血性腦損傷可引起腦組織內Aβ水平有所增多［3］。2VO造成的慢性缺血不僅導致海馬CA1區錐體細胞損傷，且可使APP裂解異常，生成Aβ增加［4］。腦內Aβ增多可通過線粒體途徑引起細胞內環境改變，導致神經細胞凋亡，Aβ的過量產生還可能導致APP非淀粉樣代謝途徑減少，使神經細胞對許多損傷的敏感性大大增加［5］，這些因素最終導致認知功能障礙。本實驗結果顯示模型組海馬區Aβ陽性細胞數量隨著缺血時間延長而逐漸增長，應用丁苯酞后發現陽性細胞數量較模型組明顯降低，且高劑量組較低劑量組下降明顯。丁苯酞可能通過減輕慢性缺血時Aβ的表達，抑制細胞色素C從線粒體內釋放入胞漿誘導的神經細胞凋亡，減輕其神經毒性作用，保護腦細胞，改善認知功能，為血管性癡呆的臨床用藥及疾病防治提供一定依據。

［1］Gold G.Diagnosis and treatment of vascular dementia ［J］.Praxis（Bern），2004，93（33）：1 311－1 316.

［2］Lorrio S，Negredo P，Roda JM，et al.Effects of memantine and galantamine given separately or in associat ion，on memory and hippocam pal neuronal loss after tran sient global cerebral ischemia in gerbils［J］.B rain Res，2009，1 254：128－137.

［3］Jendroska K，Hofmann OM，Patt S.Amyloid beta peptide and precursor protein（APP）in mild and severe brain ischemia［J］.Ann N Y Acad Sci，1997，826：401.

［4］Weinstock M，Shoham S.Rat models of dementia based on reductions in regional ucose metabolism，cerebral blood flow and cytochrome oxidase activity［J］.J Neural Transm，2004，111（3）：347.

［5］Ji ZS，Miranda RD，Newhouse YM，et al.Apolipoprotein E4potentistes amyloid beta prptide－induced lysosomal leakage and apoptosis in neuronal cells JJ［J］.Biol Chem，2002，277（24）：21 821.