產異淀粉酶嗜熱菌選育及產酶條件的研究

胡先望 ，陳 朋 ，梁 寧 ，王 雄 ，嚴曉娟

（1.甘肅省商業科技研究所，甘肅 蘭州 730010；2.甘肅農業大學動物醫學院，甘肅 蘭州 730070）

異淀粉酶在生化分類上屬于淀粉水解酶類（EC3.2.1.68）。它可以從寡聚糖的非還原末端水解切開α－1，6糖苷鍵，釋放出葡萄糖，可廣泛應用于淀粉糖漿、啤酒和酒精等的生產。近年來，以淀粉為原料利用酶技術開發出的低聚異麥芽糖因其安全無毒、理化性質獨特等優良性質而備受關注[1-2]。異淀粉酶在高濃度的葡萄糖環境中也能將游離葡萄糖殘基通過酶催化逆反應將葡萄糖苷轉移到另一底物形成α－1，6糖苷鍵，從而得到非發酵性的低聚糖[3]。以淀粉為原料，經過α-淀粉酶、β-淀粉酶和異淀粉酶（或α-葡萄糖苷酶）的協同作用，可生產低聚異麥芽糖或糖醇，其轉化率一般為55%～60%[4]。我國工業用異淀粉酶主要來自進口，近年來國內朱學軍[5]、王弋博[6]、夏靜[7]、郭宏文等[8-9]分別進行了產異淀粉酶菌種的選育工作，其他關于嗜熱異淀粉酶的研究報道則較少。筆者以嗜熱脂肪芽孢桿菌為原始菌種，進行誘變及優勢菌株選育，并對篩選出的突變菌株的產酶性質做了初步探討，旨在獲得耐高溫、活性較高、穩定性較好的產酶菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌 種 嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus，菌種編號 1.1865），購于中國科學院微生物研究所，經誘變處理得到高產異淀粉酶的突變菌株UM761。

1.1.2 儀器與試劑 儀器：TU-1800PC紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）、GL-21M離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）、MF99-3自動核酸蛋白分離層析檢測儀（上海滬西分析儀器廠）、LDZM-75型立式智能壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）、5 L全自動發酵罐（日本B.E.Marubsishi）等。試劑：瓊脂、蛋白胨、牛肉浸膏（北京雙旋微生物培養基廠）、氯化鈉、磷酸二氫鈉、醋酸鈉、冰乙酸、鹽酸、氫氧化鈉（上海試劑三廠）、可溶性淀粉（北京化工試劑廠）、硫酸銨（西安試劑廠）、3，5—二硝基水楊酸（DNS）、硝基胍、牛血清白蛋白（中科院上海生化研究所）、酵母粉（蘭州金寶瑞膠囊有限責任公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌種培養 將嗜熱脂肪芽孢桿初始菌接種于LB營養肉汁培養基中，45℃培養24 h，取菌液1 mL測定菌密度A600。當A600≥2.0后，培養液8 000 r/min離心5 min。收集上清液，測定異淀粉酶活力。

1.2.2 菌種誘變 取培養至對數期菌液10 mL（OD600=0.569），3 000 r/min離心 15 min，棄上清，用無菌生理鹽水制成菌懸液，用血球計數板在顯微鏡下計數（108個/mL）。取5 mL加入到含有0.5 mg/mL的亞硝基胍溶液的培養皿中，并將處理皿放在無菌磁力攪拌器，15 W、254 nm紫外燈30 cm處照射。用紫外燈照射復合處理，分別于30、40、50 min取出0.5 mL的培養液，加入0.5 mL 25%的硫代硫酸鈉溶液終止反應，然后稀釋涂平板，取未經NTG處理的菌液稀釋涂平板做對照。將上述平板于45℃培養20 h后計數，并計算致死率。培養20 h后，挑出大、中、小菌落48個，分別培養后并測定釋放酶活，從中選出酶活最高的菌株。

1.2.3 酶液體深層發酵培養及分離 將液體試管菌種接入三角瓶液體培養基中，45℃搖瓶培養24～96 h，隨時觀察菌種生長情況，檢測菌密度和異淀粉酶活力。培養結束后，經12 000 r/min離心過濾，上清即為粗酶液。酶液用硫酸銨沉淀，收集飽和度30%～80%的沉淀，經0.1 M pH值6.2的醋酸鹽緩沖液透析后，得到初步純化的酶產品。

1.2.4 酶活力測定 α-淀粉酶活力測定[10-12]：取一定量的酶液稀釋至合適的濃度，與1%的可溶性淀粉（溶于0.1 M pH值6.0的醋酸鹽緩沖液中）50℃反應30 min，然后添加3，5—二硝基水楊酸顯色試劑（DNS），混勻后沸水浴5 min，立即冷卻。用0.1 M pH值6.0的醋酸鹽緩沖液稀釋至合適的體積后，測540 nm處的OD值，根據標準曲線可求得水解產生的還原糖的量。酶活力單位定義為在上述條件下每分鐘水解淀粉生成1 μmol葡萄糖所需要的酶量（mL）為1 U。

異淀粉酶活力測定：取一定量的酶液稀釋至合適的濃度，與1%的普魯蘭（溶于0.1 M pH值6.0的醋酸鹽緩沖液中）50℃反應30 min，然后添加3，5—二硝基水楊酸顯色試劑（DNS），混勻后沸水浴5 min，立即冷卻。用0.1 M pH值6.0的醋酸鹽緩沖液稀釋至合適的體積后，測540 nm處的OD值，根據標準曲線可求得水解產生的還原糖的量。酶活力單位定義為在上述條件下每分鐘水解淀粉生成1 μmol葡萄糖所需要的酶量（mL）為1 U。

2 結果與分析

2.1 菌種誘變酶活測定

初始菌株嗜熱脂肪芽孢桿菌培養60～72 h，α-淀粉酶活力為1.0～1.5 U/mL，異淀粉酶活力為2.5～3.2 U/mL；經誘變篩選獲得的變異菌株UM761培養 48～60 h，α-淀粉酶活力為 0.9～1.5 U/mL，異淀粉酶活力為5.5～9.6 U/mL。與初始菌株產酶活性比較，UM761酶活比初始菌株提高了2～3倍，培養時間縮短1/4，α-淀粉酶活力基本沒變。

2.2 UM761菌種產酶條件初步優化

2.2.1 培養基不同碳源對產酶的影響 選擇葡萄糖、麥芽糖和可溶性淀粉作為菌種培養碳源，其他培養基成份和培養條件都相同，根據培養時間測定培養液的菌密度和培養液中的酶活并與碳源進行比較，結果如圖1、圖2所示，葡萄糖和可溶性淀粉是較好的碳源。選擇培養基葡萄糖的濃度分別為0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%進行搖瓶培養 72 h，并測定培養液中酶活力，結果見表1，培養基中葡萄糖濃度達到0.1%時，菌種生長及培養液中異淀粉酶生成可以達到最佳狀態。

圖1 不同碳源培養時間與細菌密度的關系

2.2.2 培養基不同氮源對產酶的影響 選擇牛肉汁、牛肉浸膏、蛋白胨、酵母粉作為菌種培養氮源，其他基成份和培養條件都相同，根據培養時間測定培養液的菌密度和培養液中的酶活并與氮源進行比較，結果如圖3、圖4所示。

圖2 不同碳源培養時間與酶活力的關系

表1 培養基中葡萄糖濃度與菌種生長的關系

圖3 不同氮源培養時間與菌密度的關系

圖4 不同氮源培養時間與酶活力的關系

牛肉浸膏和酵母粉都是較好的氮源，酵母粉也可以促進菌種的快速生長和繁殖，但沒有促進酶分泌的作用。由于牛肉汁主要用新鮮肉制得，價格昂貴，不適宜用于實際生產，因此選用牛肉浸膏、蛋白胨和酵母粉的混合物作為菌種氮源，菌種的生產周期為72 h左右，培養液酶活力可達9.0 U單位以上。

2.2.3 培養溫度對產酶活性的影響 根據以上確定的培養基，選擇培養溫度分別為35、40、42、44、45、48、50、55℃進行三角瓶振蕩培養，其他培養條件都相同，根據培養時間測定培養液的菌密度和培養液中的酶活，結果如圖5、圖6所示，菌種最佳培養溫度為44～46℃。

圖5 不同培養溫度與菌密度的關系

圖6 不同培養溫度與酶活力的關系

2.2.4 培養時間對產酶活性的影響 在最適培養條件下，每隔8 h測定培養液的酶活力，結果如圖7所示，在培養48 h時產酶活性最高，最終確定菌種最佳培養時間為48～64 h。

圖7 不同培養時間對菌株產酶活性的影響

2.2.5 培養基初始pH值對產酶活性的影響 配制不同pH值的發酵培養基，同步發酵，測定菌密度與酶活。制作培養基初始pH值與產酶的關系曲線如圖8所示。由圖8可知，菌株可在廣泛的初始pH范圍內發酵，在偏酸性近中性的環境中發酵的酶活均較高，pH值在6.2時酶活達到最高，菌種培養最佳初始pH為6.2～6.5。

圖8 不同初始pH值對產酶活性的影響

2.2.6 金屬離子對產酶活性的影響 在酶反應系統中分別添加終濃度為 10 mmol的 Co2+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Ni2+、Fe2+、Fe3+、PO43-、HPO43-、EDTA，在最適培養條件下進行培養，以不添加金屬離子酶活性為100%，計算酶的相對活性。結果如表2所示，Co2+、Mg2+、Ca2+對異淀粉酶有較強的激活作用，而Fe3+、Fe2+對酶則有較強的抑制作用，異淀粉酶在磷酸鹽中很穩定。

表2 金屬離子對酶活力的影響

3 討論

微生物所產的淀粉酶在淀粉工業運用中具有舉足輕重的作用，可以與α-淀粉酶、β-淀粉酶等水解酶相互協同，提高淀粉的轉化率，并有效地增加出糖率。嗜熱的異淀粉酶市場需求大，產品附加值高，投資回報率高，特別是嗜熱異淀粉酶工程菌的開發和應用，將填補國內空白，對增加我國酶制劑行業的品種，促進國內生物酶高新技術的研發，提高淀粉的附加值，降低生產成本，增加企業的經濟效益等都有重要的意義。研究選取嗜熱脂肪芽孢桿菌進行產異淀粉酶菌種誘變，與原始菌株相比，誘變所獲得的UM761菌株產酶效率提高了2～3倍。在此基礎上，筆者對此菌株的產酶條件做了優化，最適產酶菌株培養條件為以1%葡萄糖作為碳源，牛肉膏，蛋白胨和酵母粉的混合物作為氮源，溫度44～46℃，培養時間48～64 h，培養基初始pH值6.2～6.5。同時研究了金屬離子對產酶活性的影響，結果表明Co2+、Mg2+、Ca2+對異淀粉酶有較強的激活作用，而Fe3+、Fe2+對異淀粉酶則有較強的抑制作用，而異淀粉酶在磷酸鹽中很穩定。

[1]畢金峰，劉長江.低聚異麥芽糖的特性及其應用[J].糧油食品科技，2002，10（5）：42-44.

[2]尤 新.我國低聚糖生產技術研究進展 [J].食品工業科技，2002，23（4）：4-7.

[3]張應玖，朱學軍，關 鍵，等.一種新型淀粉酶的鑒定及其產酶菌株的篩選[J].微生物學通報，2002，29（5）：38-41.

[4]林親錄，符 瓊，周麗君.低聚異麥芽糖制備研究進展[J].食品工業科技，2011，（2）：352-354.

[5]朱學軍，李吉平，孟慶繁，等.高產新型淀粉酶菌株M S511的選育及最適產酶條件 [J].吉林大學學報（理學版），2002，40（2）：196-199.

[6]王弋博，李 博，李三相，等.異淀粉酶產生菌的分離純化及生長特性[J].青海師范大學學報（自然科學版），2003，（1）：82-85.

[7]夏 靜，陳朝銀，上官俊龍，等.一株產異淀粉酶棲熱菌的生長和產酶初步研究[J].微生物學雜志，2005，25（5）：107-109.

[8]郭宏文，冮 潔，鄒東恢.異淀粉酶產生菌的產酶性質研究[J].食品科技，2010，35（12）：17-19.

[9]郭宏文，冮 潔.異淀粉酶產生菌的篩選 [J].食品科技，2011，36（2）：8-21.

[10]趙 鵬，白曉雷，韓海霞，等.赤霉素對不同溫度下沙芥種子萌發特性及α-淀粉酶活性的影響 [J].華北農學報，2011，26（1）：127-130.

[11]劉雅琴，烏日娜，段金華.耐酸性α-淀粉酶產生菌的發酵條件優化[J].安徽農業科學，2010，38（35）：19888-19890.

[12]郭紅祥，尹 鈞.反義Trx s基因對小麥種子萌發中a-淀粉酶的影響[J].江西農業學報，2009，21（6）：1-3.