刺五加葉中黃酮類提取物的抗氧化性及抑菌作用研究

張英華，關(guān) 雪

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030）

我國刺五加資源豐富且其無毒副作用，是一種理想的天然抗氧化或防腐劑的提取源，并可以作為一種營養(yǎng)保健成分或天然的抗氧化劑添加于其他食品中。同時，植物提取物的直接開發(fā)利用，對于植物資源的綜合開發(fā)利用也具有十分重要的意義。

刺五加為五加科植物刺五加（Acanthopanax senticosus Harms）的干燥根及根莖，其莖葉也可作藥用，具有益氣健脾、補腎安神功能。它是一種我國民間常用的傳統(tǒng)中藥，具有活血，抗惡性瘧疾、抗病毒、抗腫瘤和止痛殺菌等藥效[1]，用于脾腎陽虛，體虛乏力，食欲不振，腰膝酸痛，失眠多夢。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，刺五加具有多種藥理作用和臨床應(yīng)用[2-3]。

關(guān)于刺五加的化學(xué)成分，因其具有廣泛的生理活性而受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注,其成分含多種苷類，包括酚性苷和脂苷等；但目前對刺五加中黃酮類化合物的研究卻很少。黃酮類化合物是一類重要的天然化合物，是植物產(chǎn)生的一類次生代謝產(chǎn)物，因其獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)而具有許多重要的生理、生化作用，對人體健康也起著重要的作用。早在20世紀30年代，就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有維生素C樣的活性。20世紀80年代以來，對黃酮類化合物的研究逐漸轉(zhuǎn)向其清除自由基、抗衰老及對老年性疾病的防治功效上[4]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明黃酮類物質(zhì)具有降血糖、降血脂、抗心律失常等40多種生理活性。此外，黃酮類物質(zhì)作為抗氧化劑還廣泛應(yīng)用于食品中。近年來許多試驗表明，由于合成抗氧化劑對人體的危害，如丁基羥基茴香醚可一起動物肝臟增大等作用，現(xiàn)已限制或停止使用。因此，從藥食兩用植物中篩選出高效低毒且經(jīng)濟的天然抗氧化劑成為人們關(guān)注的焦點[5]。

本試驗對刺五加中黃酮類化合物進行了定性和定量的測定，通過DPPH、清除羥自由基等方法測定了其抗氧化活性，并采用抑菌圈等實驗對黃酮類物質(zhì)的抑菌性進行研究。為進一步研究刺五加黃酮類化合物以及其開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

刺五加葉粗黃酮提取物，提取方法參照文獻[6]。

菌種：大腸桿菌，金黃色葡萄球菌、沙門氏菌及熒光假單胞菌。

1.2 試劑

蘆丁標準品、DPPH（Sigma）、番紅、EDTA、鄰苯三酚、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵、BHT、VC、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純、牛肉膏、蛋白胨等。

1.3 主要儀器

紫外分光光度計、無菌操作臺、恒溫培養(yǎng)箱、滅菌鍋、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、真空泵、水浴鍋、移液器、電子天平等。

1.4 方法

1.4.1 總黃酮含量的測定

1.4.1.1 標準曲線的繪制

準確吸取0.1 mol·L-1的蘆丁標準溶液于10 mL容量瓶中，加30%乙醇至5.0 mL，加5%亞硝酸鈉0.4 mL，搖勻，放置5 min，再加10%硝酸鋁溶液0.4 mL，搖勻，放置5 min，加4%氫氧化鈉溶液4.0 mL，搖勻，最后加30%乙醇定容至刻度，搖勻，放置10 min。在波長510 nm處測定其吸光度。以濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制標準曲線[6]。

1.4.1.2 樣品溶液的制備及含量測定

準確稱取用石油醚脫脂的刺五加粉末2 g，用70%乙醇按1∶20料液比浸泡回流提取1 h，提取3次，合并濾液，濃縮后所得濾液置于100 mL容量瓶并定容至刻度，搖勻。按1.4.1.1方法測定吸光度。

1.4.2 刺五加葉總黃酮抗氧化性測定

1.4.2.1 還原能力測定[7]

取2.5 mL不同濃度的黃酮溶液，加入0.2 mol·L-1pH 6.6磷酸鹽緩沖液2.5 mL及l(fā)%鐵氰化鉀2.5 mL，50℃水浴20 min，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL于3 000 r·min-1離心10 min，取上清液5 mL，加蒸餾水4 mL，及0.1%FeCl30.5 mL，混勻后于700 nm處測定吸光值。

1.4.2.2 清除超氧陰離子自由基實驗[8]

在10 mL試管中加入4.5 mL pH 8.2磷酸緩沖液，25℃水浴20 min，分別加入1 mL不同濃度的試樣溶液和25℃預(yù)熱的0.4 mL 25 mol·L-1的鄰苯三酚溶液并振蕩3 min后立即加入100 μL 3%抗壞血酸，振蕩均勻。在320 nm處測定吸光度。

式中，A0-不加樣品時吸光度；A1-加入樣品的吸光度；A2-不加鄰苯三酚樣品的吸光度。

1.4.2.3 清除羥基自由基實驗方法[9]

在10 mL試管中加入磷酸緩沖液1.0 mL，番紅0.2 mL，EDTANa2-Fe2+1.0 mL，再加入不同濃度的樣品溶液7.0 mL，最后加入H2O2溶液0.8 mL，混勻后于40℃水浴30 min，在520 nm處測吸光度A值。試驗結(jié)果以清除率E表示：

式中，A對照—以等體積的重蒸水代替樣品溶液和H2O2溶液的吸光度。A空白—以等體積的重蒸水代替樣品溶液的吸光度。

1.4.2.4 抑制DPPH自由基試驗[10]

在10 mL試管中分別加入取各濃度測定液2 mL及2×10-4mol·L-1DPPH 2 mL，搖勻，30 min后在517nm測定其吸光度Ai，同時測定2 mL2×10-4mol·L-1DPPH溶液與2 mL無水乙醇混合液的吸光度Ac，以及2 mL測定液與2 mL無水乙醇混合液的吸光度Aj，根據(jù)下式計算測定液對DPPH的抑制率。

1.4.3 刺五加葉總黃酮提取物抑菌性測定

1.4.3.1 不同濃度黃酮提取物抑菌效果的比較[11]

配制濃度為1，2，4，6，8 g·L-1的刺五加黃酮提取物。用已滅菌的移液管分別移取以上五種濃度的刺五加黃酮溶液4 mL至已滅菌的液體培養(yǎng)基中，用4 mL無菌水做對照。在各培養(yǎng)基中接種1 mL供試菌懸液，搖床培養(yǎng)24 h，測定在OD600菌懸液的吸光度。

1.4.3.2 抑菌圈試驗[12-15]

在上述五種不同濃度的刺五加黃酮溶液中分別放入直徑為6 mm的滅菌濾紙片，浸泡12 h，干燥后，用紫外線照射滅菌10～15 min。用無菌鑷子將浸透5種濃度的刺五加黃酮溶液的濾紙片放在含菌平板上，培養(yǎng)皿放到供試菌最適生長溫度下培養(yǎng)48 h。用游標卡尺測定抑菌圈直徑的大小，并以此判斷不同濃度的刺五加黃酮溶液對供試菌的抑制效果。結(jié)果以mm表示，生理鹽水做空白對照。為保證所測數(shù)據(jù)的精確性，每種菌作3個重復(fù)。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用單因子方差分析進行差異顯著性檢驗。與對照組比較，當P＜0.01表示具有極顯著性差異，P＜0.05表示具有顯著性差異，當P＞0.05時差異無顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的測定和回歸方程的建立

按1.4.1.1所示方法進行測定，由圖1可得回歸方程C=0.0091x-0.0073，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9992

2.2 刺五加葉中總黃酮含量

按1.4.1.2所示的方法進行測定，做3次平行，得刺五加中總黃酮化合物的含量為0.34%。

2.3 刺五加葉總黃酮抗氧化能力的測定結(jié)果

2.3.1 還原能力測定

按1.4.2.1所示方法進行測定，以樣品吸光值與濃度數(shù)據(jù)作圖，如圖2可知，刺五加黃酮樣品具有較好的還原能力，是良好的電子供應(yīng)者，其供應(yīng)的電子可以使Fe3+還原成Fe2+，且隨著刺五加黃酮濃度的增加其抗氧化能力也增加。

圖1 蘆丁溶液的標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

圖2 不同濃度的刺五加黃酮溶液還原能力的比較Fig.2 Comparison of the reductive ability of different concentrations of acanthopanax flavonoids

2.3.2 清除O2-試驗結(jié)果

按1.4.2.2所示方法進行測定，以清除率與濃度數(shù)據(jù)作圖，如圖3。以0.2 mg·mL-1BHT、VC和蘆丁標準品做對照，見表1。

表1 0.2 mg·mL-1樣品、VC、BHT及蘆丁標品清除O2-.能力的比較Table 1 Comparison of clear O2-.ability of 0.2 mg·mL-1samples,VC,BHT and rutin

圖3 不同濃度的刺五加黃酮溶液清除O2-﹒能力的比較Fig.3 Comparison of clear O2-﹒ability of different concentrations of acanthopanax flavonoids

由表1和圖3可知，不同濃度的刺五加葉黃酮類化合物及VC、BHT及蘆丁標準品都有較好的清除O2-能力，并隨著刺五加黃酮類化合物含量的增加對O2-的清除率不斷上升。當VC的濃度為0.2 mol·L-1時清除O2-能力達到78.9%，蘆丁和BHT清除O2-能力相近，分別為36.5%和42.7%，而相同濃度的刺五加黃酮的抗氧化性就不及前兩者，只有23.4%。但總的來說，刺五加黃酮有較好的清除O2-能力。

2.3.3 清除·OH試驗結(jié)果

按1.4.2.3所示方法進行測定，以清除率與濃度數(shù)據(jù)作圖，如圖4。以0.2 mg·mL-1BHT、VC和蘆丁標品做對照，結(jié)果見表2。

圖4 不同濃度的刺五加黃酮溶液清除·OH能力的比較Fig.4 The comparison of clear·OH ability of different concentrations of acanthopanax flavonoids

表2 0.2 mg·mL-1的樣品、VC、BHT及蘆丁標品清除·OH能力的比較Table 2 Comparison of clear·OH ability of 0.2 mg·mL-1samples,VC,BHT and rutin

由表2和圖4可知，不同濃度的刺五加黃酮類化合物對OH-有較強的清除能力，刺五加黃酮類化合物濃度在0.2 mg·mL-1時清除率為73.9%，并隨著刺五加黃酮濃度的增加，OH-清除能力越來越強，濃度為0.2 mg·mL-1L的蘆丁標品清除·OH的能力最強，達到91.3%。相同濃度0.2 mg·mL-1刺五加黃酮清除·OH的能力較VC要好得多。

2.3.4 清除DPPH自由基試驗結(jié)果

按1.4.2.4所示方法進行測定，以清除率與濃度數(shù)據(jù)作圖，結(jié)果見圖5。

以0.2 mg·mL-1BHT、VC和蘆丁標品做對照，結(jié)果見表3。

表3 0.2 mg·mL-1的樣品、VC、BHT及蘆丁標品清除DPPH能力的比較Table 3 Comparison of clear DPPH ability of 0.2 mg·mL-1samples,VC,BHT and rutin

圖5 不同濃度的刺五加黃酮溶液清除DPPH能力的比較Fig.5 Comparison of clear DPPH ability of different concentrations of acanthopanax flavonoids

由表3和圖5可知，在0.05～0.8 mg·mL-1的濃度范圍內(nèi)，樣品對DPPH自由基的清除能力隨著濃度的升高顯著增強。而作為對照的VC、BHT及蘆丁標品，在所選的濃度下，BHT的清除能力明顯強于樣品和VC，0.2 mg·mL-1的BHT的清除率達到68.2%，在同一濃度下，蘆丁標品的清除DPPH的能力最強，達到81.9%，VC的清除能力最弱為16.9%。

2.4 刺五加葉總黃酮提取物抑菌作用試驗結(jié)果

2.4.1 液體培養(yǎng)法測定刺五加葉中總黃酮對各菌種的抑菌效果

由圖6可知，刺五加黃酮對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌及熒光假單胞菌具有較強的抑制性，且隨著刺五加葉總黃酮濃度的不斷增加，其抑菌性能也逐漸增強。刺五加葉總黃酮提取物濃度為8 g·L-1時，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌及熒光假單胞菌的抑菌率分別為83.1%、82.2%、69.0%和57.1%，由此可初步確定刺五加葉總黃酮提取物對各種菌的抑制效果由強到弱的順序為：大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌＞沙門氏菌＞熒光假單胞菌，平板試驗結(jié)果與吸光度變化實驗結(jié)果相似。

圖6 加入不同濃度刺五加黃酮各菌懸液抑菌率的比較Fig.6 Comparison of bacteriostatios ratio of different concentrations of acanthopanax flavonoids

2.4.2 抑菌圈試驗結(jié)果

表4結(jié)果表明，刺五加葉黃酮提取物對供試菌有較顯著的抑制作用，并且隨著刺五加黃酮提取物濃度的增加，其抑菌效果明顯增高，尤其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果更佳，抑菌圈直徑分別為19.3，18.7 mm，對熒光假單胞菌的抑制效果稍弱。并且在P＜0.05范圍內(nèi)各濃度黃酮提取物間對供試菌的抑制率差異顯著。

表4 不同濃度刺五加葉黃酮提取物對供試菌的抑菌效果Table 4 Bacteriostatic effect of different concentration acanthopanax flavonoids to the test bacteria

3 討論與結(jié)論

a.本試驗采用乙醇回流法提取刺五加葉中的黃酮類化合物，采用分光光度法以蘆丁為標樣測定其中總黃酮提取物的含量為0.34%。由于試驗中僅以蘆丁為標樣進行測定，其他吸收峰由于缺乏標樣仍不能準確定性與定量。若能分離得到更多刺五加黃酮類化合物組成物質(zhì)的標樣，將有助于建立精度高的刺五加葉總黃酮含量的分析方法。

b.刺五加葉總黃酮提取物具有較明顯的抗氧化作用，并隨提取物添加量的增加而增強。通過抗氧化試驗，得到以下結(jié)論：①從清除羥自由基的試驗可以看出，刺五加黃酮提取物在低濃度時清除能力較弱，當添加濃度達0.2 mg·mL-1時清除率達到73.9%；②通過清除超氧陰離子的比較實驗表明，0.2 mg·mL-1的黃酮提取物和BHT清除O2-的清除率分別為23.4%和42.7%，說明該黃酮提取物具有較強的清除超氧陰離子能力；③從清除DPPH實驗可知，刺五加黃酮提取物的清除能力要比VC好，當濃度為0.8 mg·mL-1時，清除率為57.8%，蘆丁標準品的清除DPPH的能力最強，達到81.9%。

c.刺五加葉總黃酮提取物對各菌種均有較好的抑制作用，并隨著提取物濃度增大其抑制效果越明顯。提取物濃度為8 g·L-1時，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌及熒光假單胞菌的抑菌率分別為83.1%、82.2%、69.0%和57.1%。

通過研究可知，刺五加黃酮類成分對細菌有較強的，較廣譜的抑菌活性，不過其表現(xiàn)出的治療活性成分并未研究清楚，因此在以后的研究中要繼續(xù)對刺五加總黃酮的生物活性、藥理作用進行深入的研究，為刺五加這一野生草藥在功能食品、醫(yī)藥工業(yè)的發(fā)展提供理論依據(jù)。

總之，刺五加黃酮類化合物應(yīng)用及其廣泛，除了具有良好的抗氧化能力以外，還具有多種生物活性，如某些黃酮類化合物對心血管疾病有防治和治療的作用及抗過敏作用等。黃酮類化合物的生物活性和低毒作用使其在臨床上有巨大的潛力，但由于其含量低，分離難等自身的一些原因，給黃酮類化合物的研究帶來一定的困難。因此，黃酮類化合物的許多功能還有待進一步開發(fā)和研究。

[1]王喜旺,楊亞平.中藥刺五加化學(xué)成分研究的最新進展[J].時珍國醫(yī)國藥,2002,13(1):45.

[2]Kong X F,Yin F G,He Q H,et al.A dietary additive enhances the apparent ileal digestibility of amino acids in weaned piglets[J].Livestock Science,2009,123:261-267.

[3]張晶,劉芳芳.刺五加花蕾中黃酮和苷類成分分離及其不同部位含量測定[D].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2007:1-12.

[4]楊公明,嚴建剛.芹菜黃酮的提取及其抗氧化與降血脂作用研究[D].西安:西北農(nóng)林科技大學(xué),2004:39-48.

[5]Afidah A Rahim,Rocca E,Steinmetz J,et al.Antioxidant activities of mangrove Rhizophora apiculata bark extracts[J].Food chemistry,2008,107:200-207.

[6]陳嬡梅,石慧.加楊葉黃酮類化合物提取分離研究[D].北京:北京林業(yè)大學(xué),2008:22-24.

[7]Chang W.Choi,Sei C Kim.Antioxidant activity and free radical scavenging capacity between Korean medicinalplantsand favonoids by assay-guided comparison[J].Plant Science,2002,163:1161-1168.

[8]劉榮,趙福陽.柳蒿芽黃酮類化合物提取、純化及抗氧化活性的研究[D].哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué),2008:44-50.

[9]劉立新,張羽男,沙靖全,等.柑桔皮中黃酮類化合物的提取及抗氧化作用研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2010,41(4):103-107.

[10]田呈瑞,周一鳴.苦蕎麩皮中黃酮類化合物的提取、分離及其抗氧化活性的研究[D].陜西:陜西師范大學(xué),2008:86-95.

[11]Kaur J,Rathinam X,Kasi M,et al.Preliminary investigation on the antibacterial activity of mango(Mangifera indica L:Anacardiaceae)seed kernel[J].Asian Pacific Journal of Tropical Medicine,2010,707-710.

[12]Aziz T,Mehmet,Emin D,et al.Antioxidant and anti-microbial activities of Laetiporus sulphureus Murrill[J].Food Chemistry,2007,101:267-273.

[13]陳健處,胡靜麗.楊梅葉提取物抑菌作用的研究[D].杭州:浙江大學(xué),2002:43-44.

[14]周延峰,蔣欣梅,于廣建.大蒜素提取條件的優(yōu)化及其抑菌效果的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2009,40(6):26-29.

[15]Melinda,Krishanti P,Xavier R,et al.A comparative study on the antioxidant activity of methanolic leaf extracts of Ficus religiosa L,Chromolaena odorate King and Rabinson,Cynodon dactylon pers and Tridax procumbens L[J].Asian Pacific Journal of Tropical Medicine,2010,(3):348-350.