牛支原體蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳技術(shù)的建立及初步分析

陳 維，李 媛，辛九慶，劉 洋，張秀英

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/動物細菌病研究室，哈爾濱 150001）

牛支原體（Mycoplasma bovis,M.bovis）屬于柔膜體綱（Mollicute），支原體目（Mycoplasmatales），支原體科（Mycoplasmataceae），支原體屬（Mycoplasma），是牛肺炎、關(guān)節(jié)炎、乳腺炎和角膜結(jié)膜炎等一些其他疾病的主要病原[1-5]。該病原1961年首次在美國牛乳腺炎病例中分離得到[6]。近幾年M.bovis相關(guān)疾病的廣泛傳播給世界養(yǎng)牛業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失[7]。我國于2008年首次從呼吸道疾病病例中分離得到M.bovis病原[2]。試驗通過對M.bovis全菌蛋白樣品的制備，固相干膠條pH梯度等雙向電泳的幾個關(guān)鍵環(huán)節(jié)進行分析，建立了適合分離M.bovis蛋白的雙向凝膠電泳技術(shù)方案，得到了分辨率較高和重復(fù)性較好的電泳圖譜，并對部分蛋白進行質(zhì)譜鑒定，初步分析其功能，為進一步對M.bovis進行蛋白質(zhì)組學(xué)研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

M.bovis Hubei分離株由哈爾濱獸醫(yī)研究所細菌室支原體研究組從湖北省送檢的牛肺中分離純化及保存[2]。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備

IPG干膠條13 cm（pH 4～7和 pH 3～10）、IPG Buffer（pH 4～7和 pH 3～10）、CHAPS、二硫蘇糖醇（DTT）、尿素、硫脲、碘乙酰胺（IAA）、2D quant試劑盒，2D Clean-up試劑盒，考馬斯亮藍R350均購自美國GE healthcare公司。快速銀染試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

等電聚焦系統(tǒng)Ettan IPGphorⅢ，膠條槽Ettan IPGphor Manifold，標準垂直電泳系統(tǒng)SE 600 Ruby，掃描儀Image Scanner美國安瑪西亞公司，超速離心機美國Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品的處理

將M.bovis菌株接種于含100 mL·L-1馬血清的馬丁肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至濃度（CFU）為1×108～1×109個·mL-1時，取培養(yǎng)物14 000 r·min-1離心1 h收集菌體沉淀。將菌體沉淀洗滌3次（洗滌緩沖液：10 mmol·L-1Tris-Cl）。洗滌后將每50 mL培養(yǎng)物的菌體沉淀分裝一管于液氮中凍存?zhèn)溆谩Ｃ抗芫w沉淀用 200 μL 裂解液緩沖液（20 mmol·L-1Tris-cl pH 7.5，7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，4%CHAPS，2%IPG Buffer，40 mmol·L-1DTT），室溫振蕩裂解1 h。裂解充分后25 000 g離心1 h，取上清。

M.bovis總蛋白質(zhì)的提取：①2D Clean-up處理裂解樣品，參照試劑盒說明書操作提取蛋白。②TCA-丙酮法處理裂解樣品，每100 μL加入1 mL（10倍體積于裂解樣品）預(yù)冷（在-20℃下預(yù)冷1 h）的10%TCA-丙酮溶液，于-20℃靜置過夜后，4℃、15 000 r·min-1離心15 min，棄上清，沉淀用10倍體積于裂解樣品的預(yù)冷的90%丙酮溶液重懸，-20℃放置15 min，15 000 r·min-1離心15 min，沉淀室溫放置風(fēng)干5 min。

將上述方法提取的蛋白沉淀用200 μL（2倍體積于裂解樣品）水化液（7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，2%CHAPS，0.002%溴酚藍。上樣前加入0.5%IPG緩沖液，40 mmol·L-1DTT）重新溶解。

1.2.2 雙向電泳（2-DE）試驗

根據(jù)膠條的pH范圍和后續(xù)的染色方法吸取適量已定量樣品，參照GE Healthcare公司提供的試驗操作手冊一步完成膠條的水化、上樣和第一向等電聚焦（聚焦參數(shù)為：30 V，12 h；200 V，30 min；500 V，2 h；1 000 V，1 h；7 000 V，2 h；7 000 V，50 000 Vh）。

配制12.5%聚丙烯酰胺分離膠，將平衡后的膠條移至凝膠上端，0.5%低熔點瓊脂糖封閉IPG膠條，設(shè)置電泳程序為：5 mA·gel-1電泳1.5 h進膠，然后20 mA·gel-1，當(dāng)溴酚蘭指示線至凝膠下緣時停止電泳。將凝膠分別用考馬斯亮藍R350加熱染色和銀染染色，然后用Image Scanner掃描儀以300 dpi分辨率透射掃描凝膠，利用Image Master 2D Platinum version 6.0軟件分析凝膠圖像。銀染參照快速銀染試劑盒說明書進行。

1.2.3 圖像分析及部分蛋白點的質(zhì)譜鑒定與數(shù)據(jù)庫檢索分析

相同條件下（2D Clean-up試劑盒處理的蛋白樣品400 μg，13 cm干膠條（pH 4～7），考馬斯亮藍R350染色）重復(fù)3次，將獲得的圖譜利用Image Master 2D Platinum version 6.0軟件進行點匹配和重復(fù)性檢測。

隨機挑取重復(fù)性好的蛋白點由哈爾濱賽拓生物科技有限公司進行質(zhì)譜鑒定，并將鑒定結(jié)果與自建的M.bovis蛋白數(shù)據(jù)庫以及NCBInr數(shù)據(jù)庫檢索分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白提取方法對蛋白得率的影響

2D Clean-up試劑盒和TCA-丙酮法提取的蛋白含量分別為 10.884 mg·mL-1和 4.31 mg·mL-1，這表明利用兩種方法提取的蛋白含量差異較大，TCA-丙酮法蛋白損失多于2D Clean-up試劑盒提取。

將兩種方法提取的蛋白各上樣400 μg，在13 cm干膠條（pH 3～10）上進行雙向凝膠電泳，考馬斯亮藍R350染色，結(jié)果見圖1。

圖1 不同處理方法的雙向凝膠電泳圖譜Fig.1 Two-dimensional gel electrophoresis(2-DE)protein maps of M.bovis proteins under different treatment

由圖1可知，2D Clean-up試劑盒處理的蛋白在膠圖上展現(xiàn)了更多的點，且點聚焦效果更好，拖尾少，效果更好。

2.2 不同固定干膠條pH范圍的電泳結(jié)果

將2D Clean-up試劑盒處理的樣品400 μg，在13 cm（pH分別為3～10和 4～7）的干膠條中進行雙向凝膠電泳，考馬斯亮藍R350染色，對比結(jié)果見圖2。

由圖2-a可知，M.bovis的大部分蛋白的pI值集中分布在pH 4～7區(qū)域，但這些蛋白在pH 3～10梯度上分辨率低，而在圖2-b pH 4～7中這些蛋白距離拉開能更清晰的展示在膠圖上。

圖2 不同pH范圍雙向凝膠電泳圖譜Fig.2 Two-dimensional gel electrophoresis(2-DE)protein images of M.bovis proteins with different IPG

2.3 不同染色方法的電泳結(jié)果

將2D Clean-up試劑盒處理的樣品400 μg，在13 cm干膠條（pH 4～7）中進行雙向凝膠電泳，考馬斯亮藍R350染色，與125 μg樣品在13 cm干膠條（pH 4～7）中進行雙向凝膠電泳，快速銀染試劑盒染色對比，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，銀染法蛋白點數(shù)比考馬斯亮藍染色法多且清晰，上樣量少。

圖3 不同染色方法雙向凝膠電泳圖譜Fig.3 Two-dimensional gel electrophoresis(2-DE)protein images of M.bovis proteins with different staining

2.4 M.bovis蛋白2-DE的重復(fù)性

確定了雙向電泳各個環(huán)節(jié)之后，對相同條件（上樣量400 μg，pH 4～7 13 cm干膠條，考馬斯亮藍R350染色）的3次重復(fù)獲得的圖像進行點匹配分析，蛋白斑點檢測參數(shù)設(shè)置為：smooth 2，min area 50和saliency 50。消除干擾斑點和假斑點后，各膠的斑點數(shù)較一致（分別為506，516，538），平均斑點數(shù)為520個，Gel2與參考膠的匹配率為79.9%，Gel3與參考膠（Master）的匹配率為82.0%，平均匹配率為80.95%，膠匹配結(jié)果見圖4。

圖4 重復(fù)性檢測蛋白斑點的膠匹配結(jié)果Fig.4 Match gels of protein dots of repetitive testing

由圖4可知，Gel2和Gel3上的斑點和master凝膠上的斑點之間的匹配矢量長度很短，方位一致，說明匹配率高，重復(fù)性好。

2.5 部分蛋白點的質(zhì)譜鑒定與數(shù)據(jù)庫檢索分析結(jié)果

結(jié)果見表1。

選取重復(fù)性較好的20個蛋白質(zhì)點進行質(zhì)譜和生物信息學(xué)分析。質(zhì)譜分析后，獲得19蛋白質(zhì)點的肽質(zhì)量指紋圖譜，鑒定成功率為95%。通過檢索結(jié)果可以獲悉，蛋白點匹配率較高，分值高于82的分值限值（P＜0.05）的不同蛋白有12個，多為酶類。

表1 從蛋白質(zhì)庫搜索與質(zhì)譜結(jié)果相匹配的蛋白質(zhì)（P＜0.05）Table 1 Information of proteins whose MS results matched with that in the proteins bank(P＜0.05)

續(xù) 表

3 討論與結(jié)論

在蛋白水平上對M.bovis進行研究，對更好地揭示M.bovis的致病及免疫調(diào)節(jié)機制有重要意義[8-10]。雙向電泳是從等電點和分子量兩個方面分離和展示蛋白質(zhì)，已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中主要的技術(shù)手段[11]，本試驗通過雙向電泳幾個關(guān)鍵環(huán)節(jié)的分析優(yōu)化建立了適合于M.bovis蛋白質(zhì)的雙向電泳技術(shù)方案。

雙向電泳的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)是蛋白樣品的制備，樣品制備越簡單雜質(zhì)引入及蛋白丟失越少。實驗中菌體沉淀洗滌液含有較少的小分子鹽，對一向聚焦的影響較小。M.bovis缺乏細胞壁，在菌體洗滌后液氮中速凍，再配合裂解液室溫裂解即可充分裂解M.bovis[12]。裂解液中添加硫脲能更有效地溶解蛋白，尤其可以增加疏水性膜蛋白的溶解度[13-14]。同等條件下，2D Clean-up試劑盒比TCA-丙酮法提取的蛋白損失少，圖1結(jié)果也顯示出2D Clean-up試劑盒處理的圖蛋白點清晰和拖尾少的現(xiàn)象。低豐度蛋白質(zhì)往往具有重要的生物功能，一直是2-DE研究的熱點[15]，提高上樣量有利于低豐度蛋白質(zhì)的檢測，但上樣量過高，高豐度蛋白質(zhì)的斑點過大會掩蓋低豐度蛋白，或者聚焦時堵塞干膠條影響其他蛋白質(zhì)點的分離和分析。為了解一個新樣品蛋白的分布，最先使用寬范圍、線性pH 3～10梯度[16]，再根據(jù)感興趣蛋白的分布選擇窄范圍膠條分離。由圖2可見M.bovis的大部分蛋白的pI值分布在pH 4～7區(qū)域，在pH 3～10梯度上分辨率低。雙向電泳常用染色方法中銀染可以檢測到ng級的蛋白點，上樣量小，常用于珍貴的蛋白樣品，但其線性范圍窄，受溫度影響大，每步操作需要精確控制時間，且判斷染色終止全憑主觀經(jīng)驗，這些導(dǎo)致實驗重復(fù)性差。考馬斯亮藍染色法靈敏度低，上樣量大，但線性范圍廣，過染后還可脫色至背景清晰，所以本研究中也普遍采用考馬斯亮藍染色法。

目前國際上尚未見到對M.bovis蛋白質(zhì)組學(xué)的研究報道，因此，在今后的研究中可通過免疫印跡等方法篩選出其中與致病性相關(guān)的蛋白質(zhì)，再進行質(zhì)譜測序，從而鑒定出致病性相關(guān)蛋白，這樣可以為致病機理的研究提供蛋白質(zhì)組信息，同時也為開發(fā)M.bovis病的診斷防治方法提供幫助。

本試驗成功建立了能有效分離M.bovis全菌蛋白的2-DE技術(shù)平臺，并經(jīng)質(zhì)譜分析成功鑒定了12個蛋白。

[1]Nicholas R A J and Ayling R D.Mycoplasma bovis:Diagnosis and control[J].Res Vet Sci,2003,74:105-112.

[2]辛九慶,李媛,郭丹,等.國內(nèi)首次從患肺炎的犢牛肺臟中分離到M.bovis[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2008,30(9):661-664.

[3]Gonzalez R N and Wilson D J.Mycoplasmal mastitis in dairy herds[J].Vet Clin North Am Food Anim Pract,2003,19:199-221.

[4]Gagea M I,Bateman K G,Shanahan R A,et al.Naturally occurring Mycoplasma bovis-associated pneumonia and polyarthritis in feedlot beef calves[J].Vet Diagn Invest,2006,18:29-40.

[5]Haines D,Martin K,Clark E,et al.The immunohistochemical detection of feedlot cattle with chronic unresponsive respiratory disease and/or arthritis[J].Canadian Vet,2001,42(1):857-860.

[6]Hale H H,Hemboldt C F,Plastridge W N,et al.Bovine mastitis caused by a Mycoplasma species[J].Cornell Veterinarian,1962,52:582-591.

[7]Tschopp R,Bonnemain P,Nicolet J,et al.Epidemiological study of risk factors for Mycoplasma bovis infections in fattening calves[J].Schweiz Arch Tierheilkd,2001,143:461-467.

[8]Lysnyansky I,Rosengarten R and Yogev D.Phenotypic switching of variable surface lipoproteins in Mycoplasma bovis involves high-frequency chromosomal rearrangements[J].Bacteriol,1996,178:5395-5401.

[9]Lysnyansky I,Yogev D and Levisohn S.Molecular characterization of the Mycoplasma bovis P68 gene,encoding a basic membrane protein with homology to P48 of Mycoplasma agalactiae[J].Res Letter,2008,279:234-242.

[10]Lysnyansky I,Ron Y,Sachse K,et al.Intrachromosomal recombination within the vsp locus of Mycoplasma bovis generates a chimeric variable surface lipoprotein antigen[J].Infection and Immunity,2001,69(6):3703-3712.

[11]Hanash S.Disease proteomics[J].Nature,2003,422(6928):226-232.

[12]Wilkins M R,Jones R C,Henry R R,et al.From proteins to proteomes:large scale protein identification by two-dimensional electrophoresis and amino acid analysis[J].Biotechnology,1996,14:61-65.

[13]Rabilloud T and Adessi C.Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electr-ophoresis with immobilized pH gradients[J].Electrophoresis,1997,18:307-316.

[14]Gorg A,Obermaier C,Boguth G,et al.The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients[J].Electrophoresis,2000,21(6):1037-1053.

[15]Jungblut P R,Zimny-Arndt U,Zeindl-Eberhart E,et al.Proteomics in human disease:Cancer,heart and infectious diseases[J].Electrophoresis,1999,20(10):2100-2110.

[16]Bjellqvist B,Sanchez J C,Pasquaili C,et al.A nonlinear widerange immobilized pH gradient for two-dimensional electrophoresis and its definition in a relevant pH scale[J].Electrophoresis,1993,14(1):1357-1365.