競爭性抑制酶聯反應在量熱式農殘生物傳感器中的試驗研究

Ng u y e nVa n-l u c，于勁松，徐 斐，華澤釗

（上海理工大學食品安全研究所，上海 200093）

作為廣譜高效的有機磷殺蟲劑，甲胺磷（Methamidophos，MTD）曾廣泛用于世界各地。由于其對哺乳動物的高毒性以及其長期殘留性，近年來各國家對于甲胺磷的使用有嚴格的限制，甚至禁止使用于蔬菜及水果。但是由于違禁使用甲胺磷而導致的食品安全事件仍時有發生，因此有必要建立適用于現場檢測的快速、便捷的檢測方法[1]。目前，農藥殘留快速檢測主要基于酶抑制或免疫分析原理，結合光度法，以吸光度值作為指標，通過測定固定于載體上的殘余酶活性或標記在抗體上的酶活性來間接衡量農藥的殘留量[2]。這類光學檢測易受電化學物質和光學物質（如樣品顏色）的干擾，造成檢測結果的誤差[3]。量熱方法可克服光學方法的不足且有通用性強優點。但酶抑制法中酶與底物的反應放熱量很小，測量困難[4-5]；而免疫分析法中的氧化還原酶類的放熱量雖大，但制備單克隆抗體的成本較高[6-7]。因此，可參考以上兩種方法，基于酯酶-農藥抑制劑之間的結合和免疫學中的抗體-抗原結合都是特異性原理，將酯酶做抗體，將農藥作抗原，利用葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GOx）等氧化還原酶來標記農藥，制得酶標農藥，并使酶標農藥與待測農藥競爭性地與酯酶發生抑制結合反應（見圖1），從而獲得較大的反應熱，便于采用量熱方法來快速檢測農藥殘留。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

甲胺磷（Methamidophos，MTD）99.0%，分析純（購自于上海市農藥研究所）；丁二酸酐（99%）、葡萄糖氧化酶（EC 1.1.3.4，GOx）（購自于Sigma-Aldric公司）；樹脂（150S）（購自于英國Purlite）；雞肝新鮮（購自于上海沔青食品廠）；透析膜（購自于上海綠鳥科技發展有限公司）。

圖1 量熱式農藥殘留生物傳感器的檢測原理Fig.1 Detection principle of thermal pesticide biosensor

UV1700紫外分光光度計（日本島津公司）；THD-4006低溫恒溫循環器（寧波天恒儀器廠）；微量熱計Micro DSCII（法國SETARAM）；組織搗碎機（DS-1型）（上海標本模型廠）；離心機（90-1型）（北京通用離心機廠）；pHSJ-3F型精密酸度計（上海雷磁儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 酶標甲胺磷農藥的制備

酶標農藥采用碳二亞胺（EDC）法進行偶聯制備。具體方法是：將甲胺磷衍生物（9.65 mg，由甲胺磷與丁二酸酐合成得到）和NHS（10.74 mg），用0.4 mL N，N-二甲基甲酰胺溶解。在磁力攪拌的同時向上述溶液中緩慢加入EDC（15.34 mg），室溫攪拌反應2 h。之后將葡萄糖氧化酶（320.27 mg）溶解于0.1 M碳酸鈉緩沖溶液中，pH 9.5，溶解之后在攪拌狀態下將GOx緩慢加入到上述反應液中。然后將反應液室溫攪拌反應2 h，4℃冰箱攪拌16 h。最后將產物溶液轉入透析袋，4℃條件下用pH 7.4的PBS溶液透析72h，透析液貯于-20℃下備用。

酶標物用TNBS比色法測定酶標偶聯結合比[8-9]；酶標的酶活力測定方法是用分光光度法測定[10]。

1.2.2 雞肝酯酶的提取與固定化

將1.0 g新鮮雞肝與3.0 mL檸檬酸-檸檬酸鈉（0.025 M，pH 6.4）混合。用組織搗碎機（DS-1型，上海標本模型廠）將上述混合物打成勻漿，所得勻漿在離心機（90-1型，北京通用離心機廠）上以5 000 r·min-1的轉速離心10 min后，上清液即為雞肝酯酶。

樹脂（C150S陰離子交換樹脂）經酸堿處理好以后，按4 mL·g-1的比例，將雞肝酯酶液與樹脂混合，在搖床上搖晃一定時間后，將固定化酶樹脂與酶液分開。按樹脂∶液體=1∶10（g·mL-1）的比例，用去離子水對以上固定化酶進行洗滌。最后將固定化酶浸在蒸餾水中，于4℃條件貯存備用。

固定化雞肝酯酶的酶活力測定方法參見文獻[11]。固定化雞肝酯酶的酶活力單位為9.0±0.012 OD/g。

1.2.3 量熱法測量原理

酶促反應總是伴隨著或多或少的熱焓變化，焓值的變化范圍大部分為-5～-100 kJ·mol-1[12]。在絕熱條件下，酶反應產生的熱量變化正比于底物的摩爾焓變。存在：

式中，Q為全部的熱量變化，np為反應底物的摩爾數，ΔH為反應底物的摩爾焓變，Cp為系統的比熱，ΔT為由熱量變化產生的溫度變化。聯立兩式：

量熱傳感器可以采用熱敏電阻、熱電偶、熱電堆等。其中，熱電堆具有較小的噪聲和較高的靈敏度，它是多個熱電偶的串聯組合，輸出信號可以被放大幾倍到幾百倍。當其兩端存在溫差ΔT時，有：

式中，ΔV為輸出的電動勢信號，n為熱電堆的級數，ε是熱電系數。聯立式（3）、（4）：

可以看到輸出的電動勢信號正比于反應底物的摩爾數和焓變，即正比于反應底物的濃度及其反應熱。

1.2.4 競爭性抑制酶聯反應法的量熱測試系統設計

測熱時用到的試劑：緩沖液（0.025 M檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH 5.7）；底物（90 mmol·L-1的D-葡萄糖）；樣液（用緩沖液溶解酶標農藥或者酶標和甲胺磷到一定濃度）。試驗中用到的自主設計開發競爭性抑制酶聯反應法的量熱測試系統見圖2。

對照圖2，系統的測試過程如下：

①將固定化雞肝酯酶（0.1 g）放在DSC中，泵入緩沖液等待溫度和焓變穩定（20～30 min）；②預沖樣液（蒸餾水或酶標農藥，或酶標-甲胺磷的溶液）5 min；③靜置5 min，使固定化酶得到充分抑制；④泵入緩沖液5 min；⑤預沖底物：1 min；⑥進底物開始反應：3 min。

圖2 競爭性抑制酶聯反應法的量熱測試系統Fig.2 Calorimetric test system of competitive inhibition of enzyme reaction

試驗中獲得的熱流曲線如圖3所示，對圖3中曲線求導，選取積分起始點和終點，進行積分，扣除空白對照的熱量，即得催化反應熱。

圖3 熱流-時間曲線Fig.3 Heat-time curve

2 結果與分析

2.1 酶標農藥的酶活力及偶聯率測定

按照1.2.1中所述的方法制得了酶標農藥，在進行量熱研究之前，首先需要考察制得的酶標農藥的酶活力以及偶聯率，試驗結果如表1所示。

表1 酶標農藥的偶聯率及酶標農藥中的酶活力結果Table 1 Coupling ratio and enzyme activity determination of enzyme-labeled methamidophos

由表1可以看出，酶標農藥的酶活力是游離酶（葡萄糖氧化酶）的59%。葡萄糖氧化酶經過偶聯甲胺磷小分子后，葡萄糖氧化酶活力略有下降。

2.2 固定化雞肝酯酶量熱試驗分析

研究了固定化雞肝酯酶與其底物的反應放熱情況，以便對兩種方法的放熱量作對比分析。試驗流路見圖2，將0.1 g固定化雞肝酯酶加入DSC樣品池。樣液用蒸餾水代替，底物為一定濃度的α-乙酸萘酯，緩沖液為0.025 mol·L-1檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 5.7）。測試過程與1.2.4所述相同。最終測得樣品池中固定化雞肝酯酶的放熱為0.0095 J。

2.3 酶標農藥的放熱試驗

酶標農藥的底物（D-葡萄糖）濃度為90 mmol·L-1[13-14]。不同酶標農藥濃度催化反應熱的結果如圖4、5。從圖中可見，隨著酶標濃度的增加，放熱量亦增加。在酶標農藥濃度為0～20 μg·mL-1和0～10 μg·mL-1范圍內，酶標濃度與放熱量之間的回歸曲線為分別為y=-0.0065+0.0002，R2=0.9763； y=-0.0067x+0.0019，R2=0.9960。二者相比，0～10 μg·mL-1范圍內的線性關系較好，初步選擇酶-標濃度10 μg·mL-1進行下一步研究。

2.4 競爭性抑制酶聯反應的量熱試驗及對比分析

獲得了不同濃度酶標農藥的放熱曲線之后，進行了酶標甲胺磷與甲胺磷競爭性抑制酶聯反應的量熱研究。將不同濃度甲胺磷溶解于10 μg·mL-1酶標液中，二者的混合液作為樣液，進行量熱研究。試驗結果如圖6所示。

由圖6可知，在甲胺磷濃度為0～0.004 mg·kg-1范圍內，競爭性抑制酶聯反應測得的催化反應熱的回歸方程為：y=5.6057x-0.0322；R2=0.9985。

圖4 不同濃度酶標農藥放熱曲線Fig.4 Exotherm of enzyme-labeled pesticides

圖5 不同濃度酶標農藥放熱曲線Fig.5 Exotherm of enzyme-labeled pesticides

圖6 競爭性抑制酶聯反應催化反應熱的曲線Fig.6 Exotherm of competitive inhibition of enzyme reactions

在甲胺磷濃度為0 mg·kg-1時，焓變為-0.0316±0.0018 J，即放熱量為0.0316 J，與2.1中測得的固定化雞肝酯酶的放熱量0.0095 J相比，用競爭性抑制酶聯反應法測得的放熱量是固定化雞肝酯酶體系的3.33倍，該方法法可以有效放大反應熱量，便于進行量熱測定。根據回歸方程計算得到最低檢測限為0.0011 mg·kg-1。王華等用直接競爭ELISA試劑盒檢測甲胺磷殘留，最低檢測限為0.01 mg·kg-1[15]；Hans用GC方法測定甲胺磷殘留，最低檢測限為0.001mg·kg-1[16]。可見，本方法具有較低的檢測限，滿足實際測試需要。

3 討論

借鑒直接競爭性酶聯免疫吸附分析方法，建立“競爭性抑制酶聯反應分析方法”；并通過分析酶標農藥的偶聯率、酶標農藥濃度與待測農藥濃度以及固定化酯酶酶活之間的配比等因素對相關熱量放大的影響，初步驗證了采用該法在相關熱量放大和減少非特異性熱方面的效果。由于量熱式酶傳感器，不易受電化學活性物質或光學物質的干擾，且具有通用性強、適合于大多數生化反應等優點，正成為快速檢測食品中危害殘留的新興有效技術。但是由于相關酶反應熱量微弱以及微熱量快速測量困難等原因，量熱式酶傳感器的研究和實際應用受到限制。通過對“競爭性抑制酶聯反應分析法”在有效放大相關反應熱和消除非特異性產熱方面可能性的探索，得出了一些適用于抑制型量熱式酶生物傳感器的反應熱放大的一般規律。

本文為量熱式酶傳感器的研究提供了新方法和技術，雖然研究中采用的高精度微量熱計（DSC）已能較好地滿足微熱量測量要求，但其價格昂貴且體積龐大，無法用于現場的快速檢測。因此研究小型化的，價格適當的能滿足現場的快速檢測需要的量熱式酶傳感器將成為該研究的實施方向。

4 結論

以量熱式農殘生物傳感器為研究對象，借鑒免疫分析方法，進行競爭性抑制酶聯反應在量熱式農殘生物傳感器中的初步應用研究。結果表明，采用競爭性抑制酶聯反應法可以有效放大反應熱量，放熱量是固定化雞肝酯酶體系的3.33倍；在甲胺磷濃度為0～0.004 mg·kg-1范圍內，甲胺磷含量和放熱量的線性較好；競爭性抑制酶聯反應分析法測農藥殘留的最低檢測限為0.0011 mg·kg-1，與文獻中的數據相比，該方法可以有效放大反應熱量，且具有較低的檢測限，能夠滿足實際的測試需要；此外，扣除開機時的系統穩定時間，每次測定時間（從預沖樣液到一次測試結束）約為20 min，測定時間較短。

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