微波輔助萃取蠶沙葉綠素的工藝研究

鄧祥元，沙 鵬，高 坤

（江蘇科技大學生物與化學工程學院，江蘇 鎮江 212018）

蠶沙作為家蠶幼蟲食桑后的排泄物，具有較高的營養和藥用價值。研究表明，蠶沙中葉綠素含量約0.8%～1.0%（干物質量分數），高于其他植物中葉綠素含量[1]。從蠶沙中萃取葉綠素具有純度高、成本低、操作方便等優點。葉綠素是脂溶性卟啉類化合物。目前，葉綠素的萃取方法主要有有機溶劑法、超臨界CO2法、吸附樹脂法等[2]，其中超臨界CO2法能降低萃取時間，減少萃取劑使用量，但操作復雜、設備昂貴、成本較高，其應用領域受限。而有機溶劑法直接利用葉綠素易溶于有機溶劑的特點，選用合適有機溶劑萃取并輔助了微波、超聲波或離子交換分離等手段來提高效率和純度，其中微波輔助法，與傳統方法相比具有穿透力強、選擇性高、萃取時間短、節約能源等優點，是天然產物提取中有發展潛力的新技術。葉綠素含量的測定方法主要有分光光度法、熒光分析法、活體葉綠素儀法、光聲光譜法和高效液相色譜法等[3]，其中分光光度法具有操作方便、準確度高、重復性好等優點，廣泛應用葉綠素含量測定過程中。

本研究采用微波輔助法從蠶沙中萃取葉綠素，并利用分光光度法對葉綠素含量進行測定，通過比較分析微波壓力、微波時間及微波功率等工藝參數對葉綠素萃取效率的影響，探索其最優萃取工藝，為蠶沙葉綠素的進一步研究提供實驗數據支持，也為蠶沙葉綠素的大規模工業化開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

蠶沙由中國農業科學院蠶業研究所養蠶室提供，自然晾干后，除去桑葉渣、石灰、沙子等雜質，置于60℃烘箱中烘干，用粉碎機粉碎后，過40目標準篩，獲得干蠶沙粉，避光保存備用。

1.2 儀器和試劑

高通量密閉微波消解系統（CEM-MARS型，美國培安公司產品）；紫外-可見分光光度計（UV-1800PC型，購自上海美譜達儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9101-ISA型，上海三發科學儀器有限公司產品）；手提式中藥粉碎機（DFT-50型，購自山東青州三陽包裝設備有限公司）；所用試劑（上海國藥集團化學試劑有限公司）分析純試劑。

1.3 方法

1.3.1 葉綠素萃取方法

準確稱取0.02 g干蠶沙粉，加入0.75 mL軟化劑Na2CO3（0.05 g·mL-1）以阻止葉綠素降解成脫鎂葉綠素[4]，以4 mL丙酮比乙醇為2∶1的混合溶液為萃取劑（料液比為1∶200），在微波輔助下萃取葉綠素，萃取結束后，利用常溫離心機以5 000 r·min-1離心5 min，取上清液于光徑為1 cm的比色皿中，用紫外-可見分光光度計測定其吸光度值，并利用Arnon法的修正公式計算葉綠素a的濃度，進而比較不同工藝參數對蠶沙葉綠素萃取效率的影響。

1.3.2 單因素試驗方法

以0.02 g蠶沙粉為原料，按1.3.1的方法萃取葉綠素，并以蠶沙葉綠素a的濃度為指標，考察不同微波壓力、微波時間及微波功率等工藝參數對蠶沙葉綠素萃取效率的影響。

1.3.3 正交試驗設計方法

正交試驗設計是研究多因素多水平的一種設計方法，根據正交性從全面試驗中挑選出部分有代表性的點進行試驗，這些有代表性的點具備“均勻分散，齊整可比”的特點，是一種高效、快速、經濟的試驗設計方法。在單因素試驗的基礎上，以微波壓力、微波時間及微波功率等4因素設3水平（見表1），采用L9（34）的正交試驗，設計9組工藝萃取條件，并以蠶沙葉綠素a的濃度為指標，探索微波輔助法萃取蠶沙葉綠素的最優工藝。

表1 蠶沙葉綠素萃取的L9（34）正交試驗因素與水平設計Table 1 Factors and levels design of L9(34)orthogonal tests for chlorophyll extraction from silkworm faeces

1.3.4 葉綠素濃度的測定方法

利用紫外-可見分光光度計，在663 nm和645 nm處測量所提蠶沙葉綠素的吸光度值，然后利用Arnon法的修正公式[5-7]進行計算：

葉綠素a濃度（mg·L-1）：Ca=12.7A663-2.69A645

葉綠素a濃度（mg·g-1）：Ca'=

式中，V-萃取劑體積（mL）；n-稀釋倍數；m-樣品質量（g）；Ca和Ca'均為葉綠素a濃度，單位分別為 mg·L-1和 mg·g-1；A645、A663分別代表在波長為645和663 nm下的吸光度值，所有試驗均重復3次。

2 結果與分析

2.1 微波壓力對蠶沙葉綠素萃取效率的影響

比較微波壓力分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7和0.8 MPa時，不同微波壓力對蠶沙葉綠素萃取效率的影響。結果見圖1，結果表明，隨著微波壓力增大，葉綠素a濃度不斷升高，當微波壓力為0.4 MPa時葉綠素a濃度達到最大值，當微波壓力超過0.4 MPa后，葉綠素a濃度迅速降低。這主要是由于當達到一定壓力后，溫度迅速升高，隨著溫度升高，溶劑選擇性變差[9]，蠶沙中除葉綠素外的一些其它雜質被萃取出來；同時溫度越高，對蠶沙葉綠素的破壞作用越大，萃取劑的揮發也越快，造成萃取率的下降。因此在實際生產中，選擇0.4 MPa為微波壓力，能夠使萃取效率最大化。

圖1 微波壓力對蠶沙葉綠素萃取效率的影響Fig.1 Effect of different microwave pressures on chlorophyll extraction efficiency from silkworm faeces

2.2 微波時間對蠶沙葉綠素萃取效率的影響

設定10、20、30、40、50、60、70、80 s等8個微波時間點，比較研究不同微波萃取時間對蠶沙葉綠素萃取效率的影響結果見圖2。由圖2可知，萃取率隨著微波時間的增加而迅速增大，50 s達到最大值，說明微波處理加速了蠶沙葉綠素的浸出，隨時間的變化不顯著（P＞0.05），80 s后萃取率迅速下降（P＞0.01）。由于蠶沙葉綠素在原料與萃取劑之間的濃度差，推動著蠶沙葉綠素擴散至原料固體表面并溶解進入萃取劑。在萃取初始，兩相間濃度差較大，促進了蠶沙葉綠素快速溶解并擴散至萃取劑，隨時間的推移，蠶沙葉綠素在溶劑中的濃度不斷增大，濃度差逐漸變小，擴散速度變慢，萃取一定時間后，兩相間濃度達到平衡，萃取過程基本完成，這時繼續延長微波時間也并不能提高萃取率，反而會由于微波時間過長而造成蠶沙葉綠素的損失、雜質的溶出和溶劑的揮發[9]。因此選擇微波時間在50 s為較優的工藝條件。

2.3 微波功率對蠶沙葉綠素萃取效率的影響

取0.02 g蠶沙粉，在微波壓力為0.4 MPa的條件下，設定50、100、200和300 W的微波功率，微波處理50 s后，測定蠶沙葉綠素的吸光度值（A663和A645），并計算葉綠素a的濃度，微波功率對蠶沙葉綠素萃取效率的影響結果見圖3。由圖3可知，隨著微波功率的增加，蠶沙葉綠素的萃取率逐漸升高，在高通量密閉微波消解系統所允許的最高功率范圍內，未發現微波功率對蠶沙葉綠素萃取效率的負影響。由于隨著微波功率的增大，分子震動加快，摩擦增加，有利于葉綠素等目標成分的溶出，使葉綠素濃度較高；但由于受到儀器設備限制，本研究未能探討微波功率繼續增大是否會導致葉綠素濃度的進一步提高，但從其他研究結果來看，微波功率的繼續增大會使葉綠素濃度增加的速率變慢，未出現負影響[10]。因此，選擇微波功率為300 W是較優工藝條件。

圖2 微波時間對蠶沙葉綠素萃取效率的影響Fig.2 Effect of different microwave time on chlorophyll extraction efficiency from silkworm faeces

圖3 微波功率對蠶沙葉綠素萃取效率的影響Fig.3 Effect of different microwave output powers on chlorophyll extraction efficiency from silkworm faeces

2.4 正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，采用L9（34）的正交試驗設計進一步考察微波壓力、微波時間、微波功率3個因素對萃取效率的影響。按照1.3.3中正交試驗設計進行試驗，其試驗結果見表2。根據表2的試驗結果，從極差（R）的大小來看，影響蠶沙葉綠素萃取效率的因素大小為：微波壓力＞微波功率＞微波時間，其最優水平組合為：A2B3C3，即微波壓力為0.4 MPa、微波時間為60 s、微波功率為300 W。

此外，為了進一步確定各因素對蠶沙葉綠素萃取率的影響程度，對表2中的數據進行方差分析和顯著性檢驗，結果見表3。

表2 蠶沙葉綠素萃取的正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal tests for chlorophyll extraction from silkworm faeces

表3 蠶沙葉綠素萃取的正交試驗方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests for chlorophyll extraction from silkworm faeces

從表 3 方差分析可知，F0.05＜FC＜FA＜F0.01，表明微波壓力和微波功率對蠶沙葉綠素萃取效率的影響是顯著性因素，而微波時間則對萃取效率無顯著性影響。因此，綜合考慮生產成本等因素，應選擇的萃取工藝條件是微波壓力為0.4 MPa，微波時間為50 s，微波功率為300 W。

取3份蠶沙樣品，在選擇的工藝條件下進行蠶沙葉綠素萃取試驗，所得葉綠素a的濃度為14.325 mg·L-1，較其它條件下的葉綠素a濃度高。從而，最終確定微波輔助萃取蠶沙葉綠素的最優工藝條件是微波壓力為0.4 MPa，微波時間為50 s，微波功率為300 W。

3 討論與結論

本研究以蠶沙為原料，采用微波輔助法萃取葉綠素，并以葉綠素a的濃度為指標，通過單因素試驗和正交試驗設計優化微波輔助法的工藝條件。

a.盡管葉綠素a和b在結構上有細微的差別，但在葉綠素萃取過程中，葉綠素a和葉綠素b濃度的變化趨勢基本一致，這與眾多研究的試驗結果相同[7,11-12]，說明結構上的差異并不影響萃取過程的進行，但葉綠素a較葉綠素b的濃度高，葉綠素a/b值為3，而葉綠素a濃度容易測定、誤差較小，因此采用葉綠素a的濃度為指標優化蠶沙葉綠素的微波輔助法的萃取工藝。

b.微波壓力和微波功率是影響蠶沙葉綠素萃取效率的顯著性因素。本研究所得最優微波壓力和微波功率較其他研究低[13]。而微波時間作為影響蠶沙葉綠素萃取的非顯著因素，其優化結果與前人研究結果[13]一致。

用微波輔助法萃取蠶沙葉綠素，其最優工藝條件為：微波壓力為0.4 MPa，微波時間為50 s，微波功率為300 W。在此最優工藝條件下，蠶沙葉綠素a的濃度可達到14.325 mg·L-1。且與傳統的葉綠素萃取工藝相比，微波輔助法具有萃取時間短，萃取溫度低，工藝簡單，成本低廉，產品質量高等優點，可供工業生產蠶沙葉綠素參考。

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