干酪乳桿菌KLDS1.0381高密度培養條件研究

馬宏慧，孔保華，夏秀芳，李沛軍

（東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030）

氰干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）屬于乳桿菌屬（Lactobacillus），革蘭氏陽性，不產芽孢，無鞭毛，不運動，兼性厭氧菌，化能異養型微生物，異型發酵乳糖，不液化明膠，接觸酶陰性，最適生長溫度為37℃，G+C含量為45.6%～47.2%[1]；菌體長短不一，兩端方形，常成鏈；菌落粗糙，灰白色，有時呈微黃色，能利用葡萄糖等多種碳水化合物發酵產乳酸[2]，產酸率相對高，但其營養要求復雜，生長繁殖時需要多種氨基酸、維生素和無機鹽等[3]。

干酪乳桿菌是衛生部2001年公布的益生菌之一，也是發酵肉制品中十分重要的菌種。在肉制品中添加干酪乳桿菌后，干酪乳桿菌大量繁殖成為優勢菌群，生成乳酸，可使肉制品pH迅速下降[4]，并通過產生乳酸鏈球菌素[5]有效抑制腐敗菌和致病菌的生長和繁殖，如李斯特菌、金黃色葡萄球菌等[6-7]；乳酸菌將肉中的糖原或添加的糖轉換為酸，使肉中鹽溶蛋白質從溶膠態變為凝膠態，有利于形成良好的組織狀態[8]；同時乳酸菌能夠分解蛋白質生成氨基酸，賦予產品良好的風味[9]。目前國內外對益生菌的研究多集中在雙歧桿菌、嗜熱乳桿菌、保加利亞鏈球菌和植物乳桿菌等菌種，對于其他益生菌特別是對于可用于發酵肉制品的干酪乳桿菌的報道還不多，劉冬梅等人利用8%番茄汁、6%胡蘿卜汁、0.04%抗壞血酸以及與MRS培養基相比2.5倍的氮源的增菌培養基使干酪乳桿菌活菌數達109cfu·mL-1[10]，陳衛等對一株具有降膽固醇作用的干酪乳桿菌的增殖培養基進行了篩選和優化，所得培養基中最大菌數可達8.8×109cfu·mL-1[11]，本文中，通過對增菌培養基和培養條件的優化，可使培養后干酪乳桿菌活菌密度達1010cfu·mL-1以上。

直投式乳酸菌發酵劑具有活菌含量高、接種量少、發酵活力強、保藏期長、使用方便等特點，可使發酵制品生產更方便、產品質量更穩定[12-13]，并避免了傳統發酵劑因中間繼代培養（包括菌種活化、種子發酵劑、中間發酵劑、生產發酵劑的擴大增殖等過程）而產生菌種發酵活力退化和雜菌污染等情況[14]。

直投式發酵劑可直接向專業生產廠家生產購買，減少了菌種車間的投資，簡化了工藝，提高了勞動生產率。直投式發酵劑的制備需使乳酸菌達到高密度培養，本文優化了干酪乳桿菌的培養基配方，并對其培養條件和高密度培養物富集條件進行了研究，旨在提高培養物中干酪乳桿菌活菌密度，為進一步利用其制備直投式肉制品發酵劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種及來源

干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）KLDS1.0381，由東北農業大學食品學院乳品科學教育部重點實驗室分離鑒定并保存。

1.1.2 培養基

① 麥芽汁（Malt extract medium，MA）培養基：作為基礎培養基用于干酪乳桿菌的增殖培養。

②MRS（Man rogosa and sharp）培養基：用于干酪乳桿菌的活化、傳代。

③平板計數培養基：MRS瓊脂培養基。用于干酪乳桿菌的平板活菌計數。

1.1.3 營養因子

西紅柿、香菇、平菇、胡蘿卜均為市售優質品。分別取新鮮西紅柿、胡蘿卜、香菇和平菇500 g洗凈后切碎，加適量蒸餾水煮沸30 min，冷卻后于組織搗碎機中搗碎、過濾，濾液經離心后加蒸餾水補足至500 mL，分別得到西紅柿汁、胡蘿卜汁、香菇汁和平菇汁。

試驗用葡萄糖、蔗糖、乳糖、糊精、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白、磷酸二氫鉀、檸檬酸三銨、牛肉膏、酵母膏、吐溫80、乙酸鈉、硫酸鎂、硫酸錳等均為生化試劑或分析純。

1.2 儀器設備

DHP-9272型電熱恒溫培養箱（上海一恒科技有限公司）；SPX-250B-D型振蕩培養箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；ZHJH-1109B超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司）；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；DELTA 320 pH計（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；Allegra 64R臺式高速冷凍離心機（美國Beckman Coulter公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養方法

菌種活化：將保藏的菌種接種于MRS培養基斜面，37℃培養至出現菌落，然后再從斜面上挑取菌苔接入另一個斜面，出現菌落后，重復上面操作，連續轉接3次，既得活化菌種（菌濃度為108～109cfu·mL-1）[15]。

搖瓶發酵培養：根據本試驗室前期試驗結果，確定干酪乳桿菌培養條件為：培養溫度37℃，搖床轉數130 r·min-1，培養時間12 h[15]。

活菌計數：根據Heenan和賈士芳等[16-17]的方法稍有改動，將待測樣品按10倍梯度系列稀釋，取0.1 mL各稀釋度的菌液，滴加到MRS平板計數培養基的表面，均勻涂布后置于37℃培養48 h，每1稀釋度重復3皿，計數發酵液活菌數（cfu·mL-1）。

1.3.2 試驗設計

1.3.2.1 單因素影響試驗（60%～100%）的優化培養基，37℃培養12 h后測定發酵液中的活菌含量，以確定最佳搖瓶裝液量。

④離心條件：在0～4℃條件下，根據不同離心轉數（4 000～7 500·min-1）、離心時間（10～30 min）設計6組離心條件對培養物進行高密度濃縮，測定每組離心前后的活菌數和培養物重量，計算離心存活率和濃縮倍數，以確定最佳離心條件。

1.3.2.2 正交試驗

將乳糖添加量、胰蛋白胨添加量、西紅柿汁添加量、牛肉膏添加量選用4因素3水平的L9（34）正交進行優化試驗，正交試驗因素及其水平見表1。

試驗共9個組合，各組合設3次重復[18]。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factor and level of orthogonal experimental design (%)

1.4 統計分析

所得數據為3次重復試驗的平均值。所得數據統計分析采用Statistix 8.1軟件包中Linear Models程序進行，差異顯著性（P＜0.05）分析使用Tukey HSD程序。

2 結果與分析

2.1 菌體增殖因子的篩選

以MRS培養基的營養組成為依據，參考相關文獻，選取干酪乳桿菌的營養因子分別添加于麥芽汁培養基中，配制成多種生長培養基。分別接種活化好的干酪乳桿菌，37℃恒溫培養12 h，檢測菌懸液活菌數，測定pH，觀察每種營養因子對干酪乳桿菌的增菌效果。添加的營養因子種類、添加量及增菌效果見表2。

表2結果表明，干酪乳桿菌在本試驗中所用的20種培養基中均可正常生長并進行代謝產酸。添加乳糖、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、西紅柿汁和平菇汁的麥芽汁培養基中，干酪乳桿菌增菌效果較添加其他單因子的增菌效果顯著（P＜0.05），可以推斷，乳糖是干酪乳桿菌生長的良好碳源[19]，胰蛋白胨是干酪乳桿菌生長的良好氮源[11]，西紅柿汁和平菇汁不僅能為干酪乳桿菌生長提供氮源，而且還能提供干酪乳桿菌生長所必須的核苷酸、維生素和礦物質元素等營養成分[20]，酵母膏和牛肉膏為干酪乳桿菌提供氨基酸及維生素等營養成分[11,19]；添加緩沖鹽的麥芽汁培養基中，增菌效果較其他組增菌效果不顯著（P＜0.05），這可能是因為麥芽汁培養基中已含有大量緩沖鹽成分，在發酵培養時可以中和干酪乳桿菌代謝過程中產生的大量乳酸，解除了產物乳酸對菌體生長的抑制作用[20]；考慮到同源組內存在較小差異及經濟成本因素，本試驗選取乳糖、胰蛋白胨、牛肉膏和西紅柿汁為干酪乳桿菌的增殖培養因子。

2.2 增殖培養基配方的確定

考慮到幾種增殖因子之間可能存在聯合協同的交互作用，因而對在單因素試驗中增菌效果較明顯的四種增殖因子（乳糖、胰蛋白胨、西紅柿汁及牛肉膏）采用L9（34）正交試驗，優化干酪乳桿菌的最佳增菌培養基，結果見表3。

表2 干酪乳桿菌在添加不同營養因子的麥芽汁培養基中的菌體生長Table 2 Living cell count of Lactobacillus casei in malt extract medium with different nutritional factor

表3 正交試驗結果Table 3 Results of orthogonal experiment

表3結果表明，四個因素中，對干酪乳桿菌活菌增殖量的影響順序為B＞C＞D＞A，說明影響干酪乳桿菌生長增殖的最主要的因素是胰蛋白胨,其他三個因素依次是西紅柿汁、牛肉膏和乳糖，其中西紅柿汁和牛肉膏兩因素對干酪乳桿菌的增菌效果差異較小，而碳源對增菌作用不顯著[10]，說明氮源是干酪乳桿菌生長的主要因素，氮源含量高的培養液中干酪乳桿菌增殖迅速，這與金樁、劉冬梅等研究結果[10,21]較為一致，因此確定最佳增殖培養基配比為A2B3C3D3，即1%乳糖、2%胰蛋白胨、20%西紅柿汁和0.2%牛肉膏，在37℃培養12 h后，干酪乳桿菌活菌密度可達到1×1010cfu·mL-1以上。

2.3 初始pH對菌體增長的影響

由于搖瓶發酵過程中pH難以控制，因此本試驗采用控制液體培養基初始pH達到最佳增菌效果。將培養基初始pH調至5.5、6.0、6.5、7.0和7.5，分別接種活化好的干酪乳桿菌，37℃恒溫培養12 h，檢測菌懸液活菌數，不同初始pH的增菌效果見圖1（圖1中左邊縱軸表示0 h時培養基中干酪乳桿菌活菌數，圖右邊縱軸表示培養12 h后培養基中干酪乳桿菌活菌數）。

圖1 初始pH對菌體增長的影響Fig.1 Effect of pH on strain concentration

圖1結果表明，培養基初始pH對干酪乳桿菌菌體增長情況影響較大。干酪乳桿菌在以上5種培養基中均能正常生長代謝，但培養基初始pH為7.0的組增菌效果優于其他組，差異顯著（P＜0.05），初始pH高于或低于7.0的培養基中，增菌效果均不理想。這是因為，每種微生物都有自身生長的適宜pH范圍，當環境中的氫離子濃度超出了微生物的適應范圍，就會降低或抑制微生物的生命活動[22]。在發酵過程中，乳酸菌利用碳源、氮源等生長物質產生乳酸，隨著乳酸的積累、培養液中pH的降低，會對乳酸菌自身造成酸損傷[11,23]，隨著培養時間的延長、菌數的增加，可導致培養液pH的持續下降，在pH降至4.0左右時，就會抑制菌株的再次分裂增殖，如果pH再繼續下降，則進入衰亡期，乳酸菌細胞自身的酶類水解細胞壁肽聚糖的網絡結構，造成菌株活力減弱，最后導致菌體細胞裂解死亡[24-25]，這種現象被稱為乳酸菌的“自溶”。因此，培養基初始pH較高的組增菌效果要優于初始pH低的組。綜合考慮兩方面因素，故本試驗選取干酪乳桿菌培養基初始pH為7.0。

2.4 搖瓶裝液量對菌體增長的影響

將優化培養基按60%、70%、80%、90%及100%的裝液量分別裝于500 mL三角瓶中，接種活化好的干酪乳桿菌，37℃恒溫培養12 h，檢測菌懸液活菌數，不同搖瓶裝液量的增菌效果見表4。

表4 不同搖瓶裝液量對菌體增長的影響結果Table 4 Effect of different quantity of medium on strain concentration

表4結果表明，搖瓶裝液量對干酪乳桿菌菌體增長情況影響較大，其中裝液量為100%（500 mL/500 mL）的組較其他組增菌效果明顯，差異顯著（P＜0.05），這可能是因為干酪乳桿菌為兼性厭氧菌，雖耐氧但并不好氧，裝液量的多少會影響液體培養基中的溶氧量，對大多數微生物來說，溶氧是進行能量代謝最重要的氣相底物，并且通常是發酵的限制性因素，培養基的供氧情況影響氧化還原電位值，不同的氧化還原電位值有可能使干酪乳桿菌的代謝途徑發生改變，從而影響菌體的生長與產物的形成[26]。因此，過多的溶氧量不利于菌體生長增殖，通過試驗可以得出100%（500 mL/500 mL）為干酪乳桿菌的最佳搖瓶裝液量。

2.5 離心條件對干酪乳桿菌菌體濃縮效果的影響

本試驗共設6組離心條件對干酪乳桿菌進行高密度富集，離心后活菌存活率及濃縮效果如表6所示。

離心后菌泥中干酪乳桿菌活菌密度（cfu·g-1）=離心后活菌總數（cfu）/離心后菌泥總重量（g）

菌體富集時，選擇恰當的離心參數（離心轉數、離心時間）是尤為必要。如表5所示，離心富集乳酸桿菌菌體時，低轉速離心相比較于高轉速離心，菌體存活率高且差異顯著（P＜0.05），相同離心轉數下，短時間離心比長時間離心，菌體存活率高且差異顯著（P＜0.05），這是因為相同條件下，離心轉數越高，離心時間越長，對菌體的機械損傷越大，離心后菌體存活率越低[22-23]。同時，離心轉數的高低和離心時間的長短決定了菌體富集是否完全，低轉數、短時間離心雖有利于提高菌體存活率，卻會使菌體富集不完全，導致部分菌株還存在于上清液中，達不到期望的濃縮效果[22-23,27]，綜合考慮以上兩個方面和實際成本以及對離心機的使用維護，本試驗采用4 000 r·min-1,30 min作為干酪乳桿菌菌體富集的離心條件，離心后，菌泥中干酪乳桿菌活菌密度可達8.62×1011cfu·mL-1。

3 結論

本試驗以麥芽汁培養基為基礎培養基，通過單因素和正交試驗確定出干酪乳桿菌高密度增殖培養條件。試驗結果表明：適合干酪乳桿菌生長的最佳碳源、氮源及營養因子分別為乳糖、胰蛋白胨、西紅柿汁和牛肉膏。通過L9（34）正交試驗優化出干酪乳桿菌最佳增殖培養基配比為：1%乳糖、2%胰蛋白胨、20%西紅柿汁和0.2%牛肉膏。極差分析表明其中氮源（胰蛋白胨）是影響干酪乳桿菌生長增殖的最主要的因素。干酪乳桿菌的最佳高密度培養和富集條件為搖瓶裝液量500 mL/500 mL，初始pH為7.0，增殖培養后菌液經4 000 r·min-1離心30 min后，菌泥中活菌密度可達到8.62×1011cfu·g-1，這為下一步凍干制備直投式發酵劑奠定了基礎。

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