骨髓間充質干細胞移植對大鼠急性肺水腫病理學影響

解放軍第323醫院干三科（西安710054） 劉秋平 盧曉昭 費晉秀 王黎明 王常利 趙亞玲 王 娟

骨髓間充質干細胞（Mesenchymal stem cells， MSC）是成體干細胞的一種，其中骨髓間充質干細胞在有核細胞中只占0.001%～0.01%［1］，在一定條件下可分化為多個胚層來源的組織細胞［2］。因此，干細胞移植有可替代受損細胞，成為治療多種疾病的有效方法。急性肺水腫見于多種疾病引發的并發癥，是多種發病機理的綜合效應，是內科急危重癥。本研究應用氯化銨誘導建立大鼠急性肺水腫模型，觀察骨髓間充質干細胞預防性移植及治療性移植對肺水腫病理學變化影響，為急性肺水腫預防治療提供實驗依據。

材料與方法

1 實驗材料

1.1 SD大鼠骨髓間充質干細胞 購買廣州賽業生物科技有限公司的已分離、培養并鑒定的SD大鼠二代骨髓間質干細胞1×106，復蘇傳代后取4～6代大鼠MSCs，計數稀釋至1×105／只抽入1ml注射器備用。

1.2 實驗動物 健康SD大鼠80只，雌性，體重185±15g，購自第四軍醫大學實驗動物中心。

2. 實驗方法

2.1 實驗動物及分組 SD雌性大鼠80只，隨機分為5組，每組16只。①肺水腫組：腹腔注射6%NH4Cl 0.4ml／100g；②干細胞治療組：腹腔注射氯化銨同肺水腫組，30min后尾靜脈注射干細胞1×106／只。③干細胞預防組：尾靜脈注射干細胞1×106／只，30min后腹腔注射相同劑量氯化銨。④干細胞對照組：8只腹腔注射氯化銨同肺水腫組，30min后尾靜脈注射等量生理鹽水；另8只尾靜脈注射等量生理鹽水，30min后尾腹腔注射同劑量氯化銨。⑤空白對照組：8只腹腔注射等量生理鹽水，30min后尾靜脈注射等量無血清DMEM；另8只尾靜脈注射等量無血清DMEM，30min后腹腔等量生理鹽水。

2.2 肺重系數計算（肺重系數＝肺重量g／體重g×100% ）各組動物分別在上述處理后30min、2h、1d、7d時間點快速處死4只動物，將肺及心臟一起取出，剪除心臟及脂肪組織，用濾紙吸去肺表面液體，用天平稱兩肺重量，計算肺重系數。若肺重系數＞1%，證明肺水腫形成。

2.3 組織病理學觀察 分別對每只肺稱重后的左肺組織用10%甲醛組織固定，石蠟包埋切片HE染色。

2.4 掃描電鏡觀察 對各組每個時間點死的動物選取1只肺稱重后的右肺組織，修剪成1cm×1cm大小組織片，放入3%的戊二醛固定液進行前固定，4℃冰箱內2h以上，0.1mol／L PBS漂洗，用500，750，1000ml／L乙月青梯度脫水，JEE－4X真空蒸發儀真空干燥，JEC－I100離子濺射儀噴金處理；HITACHIS－3400N掃描電鏡下觀察。

3 統計學處理 本組所有數據采用SPSS12.0統計學軟件進行處理，對數據進行方差分析，以均數±標準差（ˉx±s）表示，P＜0.05為有顯著性差異，P＞0.01為有極顯著性差異。

結 果

1 肺重系數 見附表。肺水腫組、干細胞治療組、干細胞預防組肺重系數在注射氯化銨后的在各時間點（30min，2h，1d，7d）與相應對照組進行比較，各組在2h時間點的肺重系數與對照組比較有顯著差異（P＜0.05），其余時間點無顯著性差異（P＞0.05）。干細胞治療組在各時間點（30min，2h，1d，7d）的肺重系數與肺水腫組的比較，干細胞治療組在2h時間點的肺重系數有顯著差異（P＜0.05），其余時間點無顯著性差異（P＞0.05）。干細胞預防組在各時間點肺重系數與肺水腫組的比較無顯著性差異（P＞0.05）。

附表 干細胞治療／預防對大鼠肺重系數的影響（ˉx±s）

2 肺組織光鏡病理學變化 見圖1～7。正常肺組織肺泡腔結構正常，無滲出物，肺泡壁毛細血管無充血。肺水腫組，腹腔氯化銨注射30min時肺泡壁毛細血管輕度充血，肺泡腔出現少許粉紅色滲出物，2h肺泡腔大量滲出物，肺泡壁毛細血管明顯充血。1d，7d時部分肺泡壁增厚，肺泡腔無明顯滲出。干細胞治療組在30min時肺組織結構基本正常，2h時可見肺泡壁少許充血。1d，7d時肺泡壁、肺泡腔組織結構恢復正常。干細胞預防組肺組織病理學變化各個時間點基本與肺水腫組相同。

圖1 對照組肺泡腔結構正常，無滲出物，肺泡壁毛細血管無充血（HE×400）

圖2 肺水腫組30min時肺組織結構基本正常或肺泡腔出現少許粉紅色滲出物（HE×400）

圖3 肺水腫組2h時肺泡腔大量滲出物，肺泡壁毛細血管明顯充血（HE×400）

圖4 肺水腫組1d，7d時部分肺泡壁增厚，肺泡腔無明顯滲出（HE×400）

圖5 干細胞治療組在30min時肺組織結構基本正常（HE×400）

圖6 干細胞治療組2h時可見肺泡壁少許充血（HE×400）

3 肺組織電鏡下病理學變化 見圖8～11。對各組2h的肺組織進行掃描電鏡觀察，肺水腫組肺泡腔明顯擴大，Ⅱ型肺泡細胞結構不規整，可見少量紅細胞。干細胞治療組肺泡腔擴大，Ⅱ型細胞結構尚可，少許Ⅱ型細胞細胞脫落到肺泡腔。干細胞預防組肺泡腔擴大，肺泡腔內可見少量紅細胞，Ⅱ型細胞結構尚可，分泌顆粒有排空現象。對照組肺泡腔較小（正常），無紅細胞，Ⅱ型細胞結構完整，板層小體結構完整。

圖7 干細胞治療組7d肺泡壁、肺泡腔組織結構恢復正常（HE×400）

圖8 肺水腫組在2h時肺泡腔明顯擴大，Ⅱ型肺泡細胞結構不規整，可見少量紅細胞 （×12K）

圖9 干細胞治療組在2h時，肺泡腔擴大，Ⅱ型細胞結構尚可，少許Ⅱ型細胞細胞脫落到肺泡腔（×12K）

討 論

成人肺干細胞在正常狀態下增殖十分緩慢，當肺組織受損后通常通過局部的更新加快來修復維持細胞的狀態，但增殖潛能低，修復效果十分有限。除肺自身存在的干細胞，骨髓干細胞，包括骨髓間充質干細胞內可見少量紅細胞，Ⅱ型細胞結構尚可，分泌顆粒有排空現象（×12K）（MSCs）和造血干細胞，也可以進入“歸巢”受損肺組織，轉化為肺內細胞。Rojas等［3］將 MSCs移植到博萊霉素誘導的肺損傷小鼠體內，發現輸入體內的MSCs能定向遷移到肺損傷區域并分化為特定的肺細胞表型。MSCs移植后在肺損傷動物模型中的抗炎效應和免疫調節功能也得到進一步認識，陳莉娜等［4］研究發現，MSCs具有免疫調節作用。進一步深入研究發現［5］，受損的肺細胞能誘導MSCs的遷移，MSCs參與受損肺細胞內調節炎癥信號過程。

圖10 干細胞預防組在2h時，肺泡腔擴大，肺泡腔

圖11 對照組2h時肺泡腔較小（正常），無紅細胞，Ⅱ型細胞結構完整，板層小體結構完整（×12K）

本實驗研究發現，無論從各時間點肺重系數或是光鏡組織病理學觀察，6%氯化銨腹腔注射復制的大鼠肺水腫模型在2h時間點時，肺水腫表現最為顯著，肺泡腔可見大量滲出物，肺泡壁毛細血管明顯充血，在1d和7d時小部分肺組織出現纖維化表現。干細胞治療組在各時間點肺水腫病理學表現較肺水腫組明顯減輕，而干細胞預防組在各時間點其肺組織病理學表現與肺水腫組相近。通過電子顯微鏡對動物模型2h時間點超微結構的觀察，肺水腫組肺泡腔明顯擴大，Ⅱ型肺泡細胞結構不規整，可見少量紅細胞。干細胞治療組可見肺泡腔擴大，未見紅細胞，Ⅱ型細胞結構尚可，少許Ⅱ型細胞細胞脫落到肺泡腔。干細胞預防組肺泡腔擴大，肺泡腔內可見少量紅細胞，Ⅱ型細胞結構尚可，分泌顆粒有排空現象。對照組肺泡腔較小（正常），無紅細胞，Ⅱ型細胞結構完整，板層小體結構完整。

急性肺水腫是體液在肺間質或肺泡內積聚，大多數是由于肺毛細血管通透性增加或毛細血管內壓升高所致，很多因素可以引起肺水腫，其發生的病理學說頗多，其中腹腔注射氯化銨是誘發肺水腫模型是一種經典的方法。本實驗通過對肺水腫模型進行預防性干細胞移植及治療性干細胞移植，發現治療性干細胞移植能明顯減輕肺重系數及組織病理學改變，在急性期減輕，在恢復期未發現纖維化改變。而預防性移植組均對肺重系數及組織病理學改變急性期及恢復期無減輕，說明干細胞能移植作為對急性肺水腫治療方法，而不能作為肺水腫防護措施。這與干細胞得到肺組織受損的“信號”后，才能迅速“集結”并“歸巢“受損肺組織，修復肺組織理論一致。本實驗的結果為急性肺水腫救治及防護提供實驗學依據。

［1］ Pittenge MF，Mackay AM，Beck SC，et al.Multilneage potential of adult human mesenchymal stem cell［J］.Science，1999，284（5411）：143－145.

［2］ Prockop DJ.Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissue［J］.Science，1997，276（5309）：71－73.

［3］ Rojas M，Xu J，Woods CR，et al.Bone marrow－derived mesenchymal stem cells in repair of the injured lung［J］.Am J Repair Cell Molbiol，2005，33（2）：145－152.

［4］ 陳莉娜，王 穎，張艷艷，等.間充質干細胞的免疫調節作用［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2007，11（28）：5626－5629.

［5］ Iyer S，Rojas M.Anti－inflammatory effects of mesenchymal stem cells：novel Concept for future therapies［J］.Expert Opin Biol Ther，2008，8（5）：569－581.