BACTEC MGIT 960在二線抗結核藥物藥敏試驗中應用初探＊

陜西省結核病防治院 （西安710100） 梁亞萍 劉尚武 高 漫

耐藥結核病產生的重要原因之一是不規范的抗結核治療，使結核分枝桿菌感染難以控制。抗結核藥物特別是二線抗結核藥物的規范化使用，對耐藥結核病的防治具有十分重要的意義。早期、準確、快速的抗結核藥物敏感性檢測試驗可以為臨床的規范化治療提供可靠依據。但是，傳統的二線藥物藥敏實驗檢測方法需時較長，遠不能滿足臨床診治的需求，因此有必要建立新的結核分枝桿菌快速藥敏檢測技術。美國BD公司生產的BACTEC MGIT 960主要用于結核桿菌的快速診斷和一線藥物的藥敏檢測，目前，國外一些研究人員已經開始將其用于二線藥物藥敏檢測［1，2］。本研究利用BACTEC MGIT 960進行96例結核菌株二線藥物藥敏檢測，并與傳統的L－J比例法進行對比，探討其在二線藥物藥敏試驗中的應用價值。

材料與方法

1 標本來源 本研究的96例菌株是2009年12月至2010年6月收集本院肺結核住院患者痰標本做快速培養，陽性菌株在完成一線藥物的敏感性試驗后，選取耐藥菌株（不論何種耐藥）行二線藥物的藥物敏感性試驗，以H37RV（ATCC27294）作為陰性對照。

2 試 劑

2.1 藥物：4種二線藥物為卷曲霉素（CPM），氧氟沙星（OFLX），卡那霉素（KAN），乙硫異煙胺（ETH）均為Sigma產品。藥物使用時均按照廠家提供的純度和效價計算用量：ETH和OFLX按照1000 μg／mg計算用量，CPM 按照795μg／mg計算用量，KAN按照762μg／mg計算用量。CPM和KAN用無菌去離子水溶解，OFLX用0.1NNaOH溶解，ETH用乙二醇溶解，各藥物在培養基的終濃度，見表1。

表1 含藥培養基的終濃度

2.2 BACTEC MGIT 960用試劑：分枝桿菌生長指示管（MGIT），SIRE添加劑，生長添加劑均為BD公司產品。

2.3 L－J方法用試劑：L－J法所用對照和含藥培養基均為改良羅氏培養基，其為貝索公司產品。

3 藥敏試驗 96株結核分枝桿菌臨床分離菌株分別用MGIT 960法（以下稱960法）和L－J比例法（以下稱L－J法）測試其藥物敏感性。

3.1 接種與孵育：①960法：二線藥物藥敏試驗方法與SIRE近似：每株結核桿菌需準備5支MGIT960培養管（1管為生長對照管，4管為加藥管），每管均加入0.8ml SIRE添加劑，4支加藥管各加入100ul CPM，KAN，OFLX，ETH，藥物終濃度見表1。然后，每支加藥管加入0.5ml菌懸液（報陽當天為第0d，報陽第1～2d的標本直接加原液，3～5d的標本需用1／5無菌生理鹽水稀釋），生長對照管（GCT）加l／100無菌生理鹽水稀釋的菌懸液0.5ml。將準備好的MGIT管按GCT，CPM ，OFLX，KAN，ETH的順序放入AST試管架，系統掃描試管架條形碼，按照儀器指示位置放入BACTEC MGIT 960儀器。②L－J法從報陽第4～5d的MGIT管（報陽后需置于37℃培養箱）底部吸取適量菌液于無菌研磨器中研磨，以0.5%吐溫－80生理鹽水配成1個麥氏比濁濃度，并用生理鹽水稀釋至10－2mg／ml和10－4mg／ml的菌懸液，取稀釋好的菌懸液分別接種于對照和含藥培養基，37℃培養。

3.2 結果判定：①960法 MGIT 960儀器會在4～13d內，根據Growth Unit值，自動報告耐藥與敏感結果，但所出報告的藥物順序為CPM，OFLX，KAN，ETH。②L－J法：根據耐藥百分比判別：耐藥百分比＝（含藥培養基的菌落數／對照培養基的菌落數）×100%，若耐藥百分比＞1%為耐藥（R），≤1%為敏感（S）。

4 質量控制 每批試驗均應做質控，質控菌株為結核分枝桿菌標準株H37Rv。菌株對所有的抗結核藥物均敏感。

5 統計學方法 MGIT 960法和L－J法藥敏試驗測定結果的比較采用χ2檢驗，測定時間的比較采用t檢驗，P＜0.05表明差異有統計學意義。

結 果

1 960法與比例法藥敏結果比較：應用960法與L－J法檢測96株結核桿菌臨床分離菌株的CPM、OFLX、KAN和ETH的藥敏結果，見表2。兩法檢測CPM藥敏結果相符94株，不符2株；檢測OFLX藥敏結果相符96株，不符2株；檢測KAN藥敏結果相符86株，不符10株；檢測ETH藥敏結果相符82株，不符14株，符合率別是97.9%、97.9%、89.6%、85.4%。

表2 960法與L－J法檢測二線藥物的藥敏結果

2 960法與比例法的檢測時間：960法進行二線藥物藥敏試驗所需的時間平均9.1d，較L－J法32.5d早23.4d，二者的差異有統計學意義（P＜0.01），見表3。

表3 藥敏試驗測定所需時間（d）

討 論

近年來，全球耐藥結核病的發病率呈上升態勢［3］，已嚴重威脅人類的身體健康。耐藥結核病主要是由于濫用抗生素和不規范治療引起，因此，合理的臨床治療對于控制耐藥結核病極為關鍵。快速、準確的藥敏檢測不僅是臨床選擇和評價化療方案的有效依據，還是重要的流行病學指標，有助于我們掌握耐藥結核桿菌的分布和流行趨勢，對于控制耐壓結核病的流行和傳播至關重要。

二線抗結核藥是治療耐藥結核病的主要藥物，但目前，國內常用的二線藥物藥敏試驗—L－J比例法耗時較長，遠不能滿足臨床早期診斷和治療的需求，因此，迫切需要開展新的快速、準確二線抗結核藥耐藥性檢測技術，以指導臨床合理用藥，這對控制耐藥結核病的流行和傳播至關重要。

MGIT 960是美國BD公司在BACTAC 460基礎上不斷改進和完善的新一代熒光檢測系統，一套分枝桿菌自動快速培養及藥敏系統，已獲得美國FDA的認證。盡管沒有專門的二線藥物試劑盒，但其用于二線藥物的敏感性診斷也被 WHO認可［3］，我們研究結果也顯示：960法的CPM、OFLX、KAN、和ETH的藥敏試驗結果與L－J比例法有較高的符合率，分別為97.9%，97.9%，86.9%和85.4%。

在檢測時間方面，MGIT960法具有很大的優勢，平均9.1d就能發出藥敏報告，比L－J比例法縮短了23.4d。

MGIT 960法不足之處是需要昂貴的儀器設備，且檢測費用較高。

綜上所述，MGIT 960所得的二線藥物藥敏結果與傳統比例法有較好的一致性，所需的檢測時間較短，若患者經濟條件允許，建議選擇MGIT 960方法進行二線藥物藥敏試驗，以便能更快速、準確地提供耐藥報告。

［1］ Kruuner A，Yates M D，Drobniewski F A.Evaluation of MGIT 960－based antimicrobial testing and determination of critical concentrations of first－and second－line antimicrobial drugs with drug－resistant clinical strains of M.tuberculosis［J］.J Clin Microbiol，2006，44（3）：811－818.

［2］ Rüsch－Gerdes S，Pfyffer G E，Casal M，etal.Multicenter laboratory validation of drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis against classical secondline drugs and newer antimicrobials by Bactec MGIT 960 Technique［J］.J Clin Microbiol，2006，44（3）：688－692.

［3］ Aziz M A，Wright A，Laszlo A，etal.Epidemiology of antituberculosis drug resistance（the Global Project on Anti－Tuberculosis Drug Resistance Surveillance）：an updated analysis ［J］.Lancet，2006，368（9553）：2142－2154.