乙型肝炎病毒外膜大蛋白檢測及臨床應用

西安交通大學醫學院第二附屬醫院檢驗科（西安710004）

李妙羨 吳曉康 王香玲 耿 燕 盧 潔 王小利 張 妮 魏雅鳳

乙型肝炎病毒（HBV）為嗜肝DNA病毒，含有3200個核苷酸，其中S基因編碼合成的HBV外膜蛋由3種蛋白組成，包括主蛋白（即HBsAg），中蛋白（即HBsAg和Pre－S2蛋白）和大蛋白（即 HBsAg、Pre－S1蛋白 和 Pre－S2 蛋 白）［1］。大 蛋 白 存 在 于 感 染 顆 粒（Dane顆粒）和亞病毒管狀顆粒上，是病毒形成完整外膜的重要標志，與病毒復制密切相關，對HBV復制過程具有反式激活作用，并與病毒顆粒從細胞內釋放有關，乙肝病毒外膜大蛋白（HBV－LP）在肝細胞內質網積聚是導致內質網應激的關鍵因素，并與肝細胞毒性甚至肝癌相關［2］。近年來隨著對HBV外膜蛋白研究的深入，發現其有雙重跨膜拓撲結構［3］，這是 HBVLP發揮多功能作用的依賴性結構。通過其在乙型肝炎發病機制、感染與病毒復制等方面的研究，使人們逐漸認識到了其越來越重要的臨床意義。筆者檢測了238例 HBV－M 陽性血清中 HBV－LP 、HBV－DNA、Pre－S1－A，并進行了分析，探討其在臨床中的應用。

材料和方法

1 材 料 收集2012年1月至2012年3月西安交通大學醫學院第二附屬醫院門診及住院患者278例，其中 HBV－M 陽性患者血清238例 （HBsAg、HBeAg、HBcAb陽性65例；HBsAg、HBeAb、HB－cAb陽性116例；HBsAg、HBcAb陽性53例；HB－sAg、HBeAg、4例），男143例，女95例，年齡2～73歲，平均35.3歲；正常對照40例，男18例；女22例，年齡7～63歲，平均40.3歲，GPT、GOP、HBV－M、HBV DNA、HBV－LP及 Pre－S1－Ag均為正常。所有血清標本均于－80℃保存。

2 方 法

2.1 HBV DNA檢測：采用實時熒光定量聚合酶鏈反應技術（PCR）檢測，儀器為美國ABI公司7500型擴增儀，試劑盒（YZB／國0371－2009）購自廣州中山大學達安基因公司，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。HBV DNA陽性判斷標準標準：HBV DNA含量≥103IU／ml為陽性。

2.2 乙型肝炎病毒Pre－S1－Ag檢測：采用酶聯免疫 （ELISA）技術，試劑 （YZB／國0371－2009）購自上海阿爾法生物技術有限公司，儀器為雷杜6100型酶標儀及3900型洗板機，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。Pre－S1－Ag陽性判斷標準：S／CO≥1為陽性。

2.3 HBV－M檢測：采用酶聯免疫 （ELISA）技術，試劑盒 （YZB／國0371－2009）購自于北京萬泰生物技術有限公司，儀器為雷杜6100型酶標儀及3900型洗板機，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。HBV－M陽性判斷標準：HBsAg、HBsAb、HBeAg為S／CO≥1為陽性；HBeAb、HBcAb為S／CO≤1為陽性。

2.4 HBV－LP檢測：采用酶聯免疫 （ELISA）技術，試劑盒 （YZB／國0371－2009）為北京熱景生物技術有限公司贈送，儀器為雷杜6100型酶標儀及3900型洗板機，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。HBV－LP陽性判斷標準：S／CO≥1為陽性。

以上四種試劑均在有效期內并有試劑盒內、外質控（除 HBV－LP）。

3 統計學方法 采用χ2檢驗。

結 果

1 HBV DNA與HBV－LP陽性率比較：HBV DNA與HBV－LP陽性率比較，見表1。238例HBVM陽性患者血清同步檢測HBV DNA和HBV－LP，結果顯示，HBV DNA陽性（＋）174例，陽性率為73.11%（174／238）；HBV－LP陽性（＋）198例，陽性率為83.19%（198／238）。以 HBV DNA 和 HBV－LP為判斷病毒復制指標，有顯著性差異（P＜0.05）。

表1 HBV DNA與HBV－LP檢測結果

2 Pre－S1－Ag與 HBV－LP陽性率比較：Pre－S1－Ag與HBV－LP陽性率比較，見表2。238例 HBV－M陽性患者血清同步檢測Pre－S1－Ag和 HBV－LP，結果顯示，HBV－LP陽性（＋）198例，陽性率為83.19%（198／238）；Pre－S1－Ag1陽 性 （＋ ）184 例，陽 性 率 為77.31%（184／238）；二者有顯著性差異（P＜0.05）。

表2 Pre－S1－Ag與 HBV－LP檢測結果

3 HBV標志物不同模式HBV DNA與HBV－LP檢出率比較：HBV標志物不同模式HBV DNA與HBV－LP檢出率，見表3。238例HBV－M陽性患者血清同步檢測HBV標志物、HBV DNA和HBV－LP，結果顯示，65例HBsAg、HBeAg、HBcAb陽性（＋）標本中 HBV DNA，陽性率為95.4%（62／65），HBV－LP陽性率為96.9%（63／65）；116例 HBsAg、HBeAb 、HBcAb陽性（＋）標本中HBV DNA陽性率為67.0%（80／116），HBV－LP陽性率為75.9%（88／116）；4例HBsAg、HBeAg陽性（＋）標本中HBV DNA陽性率為100.0%（4／4），HBV－LP陽性率為100.0%（4／4）；以上三種模式，HBV DNA與HBV－LP的陽性率比較無顯著性差異（P﹥0.05）；53例 HBsAg、HBcAb陽性（＋）標本中 HBV DNA 陽性率為52.8%（28／53），HBV－LP陽性率為84.9%（45／53），二者比較有顯著性差異（P＜0.05）。

4 正常對照40例，GPT、GOP、HBV－M、HBV DNA、Pre－S1－Ag及 HBV－LP檢測均為陰性。

表3 HBV標志物不同模式HBV DNA與HBV－LP檢出率比較

討 論

乙型肝炎具有較強傳染性，且病后發生肝硬化、肝癌的相對危險度增高［4］，對患者生活、健康等造成嚴重影響，因此如何通過實驗室檢測手段對乙肝的診斷、抗病毒治療、病情進展情況及病毒復制進行監測評估是該病防治工作的重要一環。目前，常以外周血HBV DNA、HBeAg、Pre－S1－Ag作為臨床判斷 HBV病毒復制程度的指標，HBV DNA定量檢測結果也已成為抗病毒治療效果和患者預后判斷的重要依據。但由于HBV DNA前C區nt1896位和基本核心啟動子區（BCP）1762、1764位聯合突變導致 HBeAg陰性乙型肝炎、以及由核苷類藥物對HBV DNA復制的快速抑制，使患者血清中保留著低水平HBV DNA，加之，在HBV形成包膜的過程中需要大蛋白（即HBsAg、Pre－S1蛋白和Pre－S2蛋白）和中蛋白參與［5］，因此檢測Pre－S蛋白的存在對于判斷HBV復制具有一定的意義。以往檢測是通過檢測大蛋白的獨有片斷Pre－S1蛋白來實現的［6］，但是編碼 Pre－S蛋白的 HBV－LP Pre－S區具有較復雜的雙重拓撲結構［3］，導致 Pre－S1－Ag的檢出率低［7，8］不能很好反映HBV的復制情況。基于以上原因，可能造成假陰性結果，該研究也證明了這一點，近年來國內外關于乙型肝炎病毒包膜蛋白結構的大量研究證明，HBV－LP主要存在于不含核酸的亞病毒顆粒以及完整的乙型肝炎病毒顆粒，且與乙型肝炎病毒的復制有著密切的關系，能在一定程度上反映乙型肝炎病毒復制情況［9］，病毒復制期HBV－LP大量滯留在肝細胞中，對肝細胞有直接的毒性作用，且對HBV復制的過程具有反式激活作用，并與病毒顆粒從細胞內釋放調節有關［2］，有研究表明在治療應答過程中HBV－LP比HBV DNA陰轉大約5個月，在不同的個體可能時間不一樣［10］，所以 HBV－LP的檢測對乙型肝炎的診斷、治療效果的觀察以及是否治療徹底有非常重要。

本研究我們通過對患者血清中HBV－LP、HBV DNA、HBV－M 及 Pre－S1－Ag進行了檢測，結果顯示：HBV－LP能夠反映HBV的復制情況，血清中HBVLP含量與 HBV DNA、Pre－S1－Ag和 HBeAg有著很好的相關性；且比 HBV DNA、Pre－S1－Ag和 HBeAg能更好的反映HBV復制水平；HBV－LP在 HBV感染的不同模式中：HBsAg、HBeAg、HBcAb；HB－sAg、HBeAb、HBcAb；HBsAg、HBeAg；三種模式，HBV DNA與HBV－LP的陽性率基本一致；HBsAg、HBcAb 模式HBV DNA與HBV－LP檢測陽性率差異非常大。說明HBV－LP在HBV感染血清中比HBV DNA、Pre－S1－Ag和 HBeAg更敏感，分析其原因：①血清HBeAg陰性結果不能說明不存在HBV病毒復制時［11，12］，可能與長期抗病毒治療導致基因變異造成抗原合成障礙有關；②血清HBV DNA陰性同樣不是一定表明患者體內的HBV病毒完全清除可能是因為HBV DNA檢測的靈敏度有限或水平較低，有研究表明血清HBV DNA水平較低時，肝臟內仍可存在一定量的HBV DNA；③以往檢測血清HBV－LP是通過檢測其獨有片段Pre－S1－Ag來實現，但是編碼Pre－S蛋白的 HBV－LP Pre－S區具有較復雜的拓撲結構［3］導致Pre－S1－Ag檢出率較低；④HBV－LP（即 HBsAg、Pre－S1蛋白和 Pre－S2蛋白）［1］，涵蓋范圍廣檢測陽性率高。HBV患者血清中 HBV－LP的檢測，可彌補HBV DNA檢測在HBV患者抗病毒治療終點判斷及療效評估中的不足，當HBV患者血清中HBeAg、HBV DNA、Pre－S1－Ag陰性時，通過檢測 HBV－LP可了解體內HBV病毒復制、疾病進展情況及抗病毒療效與預后，有效阻止病情進一步惡化。在HBV感染者HBV DNA陰性患者的血清中檢測HBV－LP陽性，對停藥反彈具有很好的臨床指導意義。

綜上所述，HBV－LP、HBV DNA、HBeAg及Pre－S1－Ag四種標志物，從靈敏度來說，HBV－LP（83.1%）＞Pre－S1－Ag（77.3%）＞ HBV DNA（73.1%）＞HBeAg（54.1%）。筆者認為對 HBV患者，特別是HBeAg和HBV DNA陰性患者，檢測血清中HBVLP含量對患者疾病進展情況及抗病毒療效與預后，阻止病情進一步惡化及對停藥反彈評估尤為重要；HBV－LP陰轉是否能作為預示抗病毒治療較為徹底有待于進一步觀察。HBV－LP檢測操作簡單、快速、無需特殊儀器設備，適合各級醫院推廣應用，尤其對那些無條件開展HBV DNA檢測單位，檢測HBV－LP就更有意義，如果條件允許同時檢測血清中HBV－M、HBV－LP、HBV－DNA 及 Pre－S1－Ag標志物能有效降低單項檢測的漏檢風險。HBV－LP可作為病毒復制指標同時也是常規檢測的一個補充指標。

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