水楊酸鈉對高游離脂肪酸大鼠胰腺組織氧化應激水平的影響＊

中國醫科大學附屬盛京醫院內分泌科（沈陽110004） 何 冰 馬曉丹 張 微 韓 萍

血漿游離脂肪酸（FFA）升高是2型糖尿病和肥胖癥的臨床特征，增多的FFA超過脂肪組織貯備能力及周圍組織氧化能力，以甘油三酯的形式在非脂肪組織沉積造成該組織的損傷，如在胰島中過多沉積可以使胰島β細胞凋亡加速并使其功能減退［1］。最近有報道，水楊酸鹽可能改善高FFA引起的胰島β細胞凋亡，機制不清［2］。胰腺組織抗氧化能力差，FFA增多可使胰腺氧化應激增強，導致β細胞凋亡［3］。本研究擬觀察水楊酸鈉對脂肪乳誘導的高游離脂肪酸大鼠胰腺組織氧化應激水平的影響。

材料與方法

1 動物模型 雄性Wistar大鼠48只，體重230～260g，中國醫科大學動物室提供，合格證號SYXK2003－0019，常規飼料自由飲水。10%水合氯醛腹腔麻醉，將聚乙烯導管2根，每根一端接有一段3cm長的硅膠管分別植入右頸內靜脈用于輸液和左頸動脈用于采血［4］，大鼠術后恢復3d。

2 實驗設計 大鼠隨機分為三組，每組7只：生理鹽水組（SAL組）靜脈輸注生理鹽水，脂肪乳組（IH組）輸注20%脂肪乳＋20U／ml肝素，水楊酸鈉＋脂肪乳組（SI組）輸注脂肪乳同時輸注水楊酸鈉，各組輸液時間為48h，速度5.5μl／min，水楊酸鈉以0.117mg／（kg·min）輸注。所有實驗組均在試驗的最后30min，每10min采動脈血一次，備測血糖、胰島素、FFA和C肽。輸液48h后，剖腹取胰腺，液氮冷凍。

3 實驗方法

3.1 葡萄糖氧化酶法測定血糖（BIOSEN5030，德國），放射免疫法測定胰島素和C肽（解放軍總醫院科技開發中心放免研究所），比色法測定血漿FFA、胰腺組織丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）活性（南京建成生物公司）。

3.2 RT－PCR半定量測定胰島素基因合成調控因子－1mRNA的表達：提取RNA逆轉錄方法獲取cDNA后進行擴增。胰島素基因合成調控因子－1（PDX－1）上游引物5＇－ACATCTCCCCATACGAAGTGCC－3＇，下游 5＇－AAGTGAGCATCACTGCCAGCTCC－3＇，產物長度364bp。以 GAPDH 為內參，5＇－GTTCAACGGCACAGTCAAGG－3＇，下 游 5＇－CACCAGTGGATGCAGGGAT－3＇，產物長度473bp。PCR產物經Bio－VT凝膠成像系統成像，ID Image Analysis Software半定量分析，以GAPDH為對照，PDX－1與其相比得到相對表達量，取均值。

4 統計學處理 數據以ˉx±s表示，采用單因素方差分析比較三組資料間差別，變量相關關系用直線相關和多元線性回歸分析，應用SPSS.11.5軟件進行數據統計。

結 果

1 三組大鼠血漿FFA、葡萄糖、胰島素及C－肽比較 與SAL組比較，IH組FFA增加2.4倍，血糖升高0.3倍，胰島素和C－肽分別增加了1.6倍、1.5倍（P＜0.01）。輸注水楊酸鈉可輕度降低血漿FFA水平，血糖下降至IH組78%，胰島素和C肽水平也分別下降29%、26%（P＜0.05），見表1。

表1 三組大鼠血漿FFA、葡萄糖、胰島素和C－肽水平比較（xˉ±s，n＝7）

2 三組大鼠胰腺組織中 MDA、SOD及 MDA／SOD比較 輸注脂肪乳使胰腺組織中MDA含量明顯增加，水楊酸鈉使組織中 MDA降低40%（P＜0.05）。SOD是抗氧化標志物，與SAL組比較，IH組SOD活性增加0.4倍，水楊酸鈉對其沒有影響。進一步用 MDA／SOD評估氧化應激程度，IH 組 MDA／SOD是SAL組1.6倍（P＜0.01），水楊酸鈉阻斷了脂肪乳引起的MDA／SOD增高（P＜0.05），見表2。

3 三組大鼠胰腺組織中PDX－1mRNA表達比較與SAL組比較，IH組PDX－1mRNA相對表達量減少30%，水楊酸鈉使PDX－1mRNA升高20%（P＜0.05），見表2。

4 相關分析 多元線性回歸分析顯示胰腺MDA／SOD與組織中PDX－1mRNA表達呈負相關（r＝－0.62，P＝0.011）。

表2 三組大鼠胰腺組織內MDA、SOD、MDA／SOD及PDX－1mRNA表達比較（ˉx±S，n＝7）

討 論

輸注脂肪乳48h，血漿FFA增加，胰島素水平升高，與C－肽升高相一致，表明高FFA增加了內源胰島素分泌。輸注水楊酸鈉，大鼠內源性胰島素分泌降低，血糖下降。乙酰水楊酸可促進脂肪酸氧化，降低FFA水平［5］。本研究僅觀察到水楊酸鈉對FFA有降低趨勢，但沒有達到統計學意義。

胰腺組織抗氧化能力差，給大鼠輸注脂肪乳48h，使FFA升高，胰腺組織反映脂質過氧化、細胞受自由基攻擊損傷程度標志物MDA含量增多，同時反映抗氧化能力的酶SOD活力也相應增強，分析可能是組織對局部過度氧化的保護機制，但SOD升高比例與MDA增加比例并不平行，MDA與SOD的比率明顯增加，表明腺組織內氧化應激反應增強，活性氧簇增多（ROS）［6］。ROS類似于第二信使，可以激活多個氧化還原敏感性信號通路，進而使胰島β細胞凋亡加速并使其功能減退［7］。PDX－1不僅是一種重要的胰島素轉錄因子，還是調節胰腺發育和胰島細胞分化的核因子，PDX－1表達減少，會使胰島β細胞對凋亡因子敏感性增強，細胞中抗凋亡蛋白Bcl－2和Bcl－XL減少，最終使胰島β細胞凋亡數增多［8］。本研究觀察到，血漿FFA增多，可以抑制PDX－1mRNA表達，且胰腺組織中PDX－1mRNA表達量與組織內MDA與SOD比率，即與氧化損傷的強度呈顯著負相關。注水楊酸鈉使MDA與SOD比率明顯下降，PDX－1mRNA表達增加。

總之，本研究證實FFA增高引起胰腺組織氧化應激增強可能是導致胰島β細胞凋亡加速的機制之一。應用水楊酸鈉胰腺組織氧化應激反應減弱，PDX－1mRNA表達增加，抗炎藥水楊酸鈉可能通過降低胰腺氧化應激而發揮保護胰島β細胞功能的作用。

［1］ 楊文英.從脂毒性到糖尿病再到血脂異常［J］.國外醫學內分泌分冊，2004，24（2）：287－288.

［2］ Jose M，Abel B，Ana B，etal.Salicylate increase insulin secrection in healthy obese subjects［J］.J Clin Endocrinol Metab，2011，93（7）：2523－2530.

［3］ Richard N.Free Fatty Acids and pathogenesis of type 2 diabetes mellitus［J］.Trends in Endocrinol Metab，2000，11（9）：351－356.

［4］ 何 冰，趙 晟，張 威，等.水楊酸鈉對大鼠脂肪組織炎癥因子表達的影響［J］.陜西醫學雜志，2009，38（3）：267－269.

［5］ Van der Crabben SN，Allick G，Ackermans MT，et al.Prolonged fasting induces peripheral insulin resistance，which is not ameliorated by high－dose salicylate［J］.J Clin Endocrinol Metab，2008，93（2）：638－641.

［6］ Zhang X， Bao Y，Ke L，et al.Elevated circulating free fatty acids levels causing pancreatic islet cell dysfunction through oxidative stress［J］.J Endocrinol Invest，2010，33（6）：388－394.

［7］ Marc Y，Jan A，Ehses K，et al.Mechanisms ofβ－cell death in type 2diabetes［J］.Diabetes，2009，54（suppl.2）：S108－113.

［8］ 徐彩棉，趙瑞景，朱鐵年.PDX－1及其對胰島B細胞的調控作用［J］.國際病理科學與臨床雜志，2006，26（1）：55－58.