精神分裂癥大鼠血漿 H2S、Hcy、葉酸及 VitB6水平及其相關性分析

張國富 任彩麗 祁曙光 張云彪 陸志新 呂振雷

硫化氫(H2S)是蛋氨酸代謝的終產物,在 Hcy代謝過程中,可由 CBS催化半胱氨酸生成,CBS同時是 H2S生成的關鍵酶。越來越多的研究證實 H2S在神經系統中有重要的生理作用。由此推測,H2S作為 Hcy代謝的終產物,可能參與了高同型半胱氨酸血癥致精神分裂癥的發病機制。同型半胱氨酸(Hcy)來源于飲食中攝取的必需氨基酸蛋氨酸,是蛋氨酸循環的中間代謝產物之一,參與體內去甲腎上腺素 (NE)、DN A、蛋白質等重要物質的甲基化反應。研究發現,精神分裂癥患者存在 Hcy水平異常升高[1-2]。后者是由于機體內 Hcy代謝相關酶胱硫醚-β-合酶(CBS)和 /或 5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(M THFR)基因突變或輔助因子葉酸、維生素(Vit)B12及維生素(Vit)B6缺乏所導致。但 Hcy致精神分裂癥的確切機制仍不十分清楚。為探討這一機制本研究對精神分裂癥大鼠模型的血漿 H2S、Hcy以及葉酸、VitB6水平進行檢測,并分析其相關性。苯環已哌啶(PCP)是廣泛應用于制作精神分裂癥動物模型的藥物[3],對研究精神分裂癥的發病及治療有較高的價值,國內對 PCP所致精神分裂癥模型很少報道。

1 對象與方法

1.1 對象 實驗動物:實驗動物選用成年雄性 Spraqui-Dawlay大鼠 16只 ,體重 280～320g,籠養 ,每籠 4只 ,置于室溫 25℃,自然晝夜循環非直接光照條件下生活,自由進食、飲水。實驗動物由南京醫科大學動物中心提供。藥物:Phencyclidine(PCP)由美國 Sigma公司提供,溶于 0.9%的生理鹽水。

1.2 方法

1.2.1 精神分裂癥動物模型的建立 參照 Sams-Dodd制作精神分裂癥動物模型的方法[4],PCP組每日腹腔注射(i.p)PCP7.1/umol/kg(2.0mg/kg),連續注射 3天。正常對照組給予等體積生理鹽水。各組均于末次注射后觀察每只大鼠的刻板行為和社會行為,刻板行為每 10分鐘評分 1次,觀察 60分鐘,取其平均值。刻板行為評分標準和社會行為觀察參考Sams-Dodd的刻板行為評分標準:0分 ,靜止不動 ,幾乎或根本沒有活動;1分,正常活動,偶爾有向前的運動;2分,活動伴隨反復的向前探索(大鼠以刻板行為沿籠子周邊轉圈,且無其他行為 );3分,連續地向前探索;4分,重復地抬頭、搖頭或旋轉;5分,快速地搖頭、轉圈或頭的背腹運動(通常大鼠靜止不動)。社會行為是指大鼠對新環境的探索行為,包括不停地嗅探、環繞新區域運動、有規律地抬起前肢向四周探望和接觸周圍陌生大鼠等社會行為,PCP組大鼠的社會行為和探索行為明顯減少,常不停地以某種刻板形式沿著籠子的周邊運動,且避開或忽視與別的不熟悉的大鼠接觸,同時有規律的抬頭行為明顯減少。刻板行為評分:正常組 1分 ,PCP組 2～3分,符合模型標準。

1.2.2 血漿 Hcy、葉酸及維生素 B6水平測定 精神分裂癥組早晨用真空采血管采空腹血 5 ml(肝素抗凝),3000 r/min離心,取出血漿放入-80℃冰箱內儲存。血清 Hcy水平采用酶聯免疫法測定,由美國雅培公司產 IMX全自動免疫分析儀及其配套試劑進行檢測,正常值范圍 5～15 μmol/L。血清葉酸、VitB6水平應用化學發光法測定,用化學發光儀(ACS180SE,德國貝爾公司)及其配套試劑進行檢測。

1.2.3 血漿 H2S水平測定 采用去蛋白方法,在試管中加入 1%醋酸鋅 0.25ml,然后加入 0.1ml血漿,使血漿中的硫離子與醋酸鋅充分結合形成醋酸鋅膠體,再加入 20 mmol/L對苯二胺鹽酸鹽 7.2 mmol/L HCl 250μl和 30 mmol/L三氯化鐵 1.2 mmol/L HCl 250μl,室溫孵育 20 min,使之充分顯色,加入 10%三氯醋酸 0.5 ml,使蛋白沉淀,離心(6000r/min),5 min,吸取上清液,用全自動酶標儀 (Bio- Tek Elx800,美國)在波長 665 nm處檢測吸光度,根據 NaHS標準曲線計算血漿中 H2S的含量 ,結果以μmol/L表示。

1.3 統計處理 所有數據采用t檢驗及直線相關分析,應用SPSS12.0軟件進行統計學處理。

2 結 果

2.1 精神分裂癥組和正常對照組血漿 H2S及 Hcy、葉酸、VitB6水平和 Hhcy檢出率的比較 精神分裂癥組、對照組血漿 Hcy水平分別為 10.5～ 38.6 μmol/L和 4.9～ 17.5μmol/L,兩組間差異具有統計學意義(P＜0.001),見表1。將血漿中Hcy＞ 15 μmol/L確定為 Hcy。精神分裂癥組 Hcy的占 45.5%,對照組僅占 10%,明顯高于對照組,差異具有顯著性(i2=15.66,P＜0.001)。

表1 精神分裂癥組和正常對照組血漿 H2S、Hcy、葉酸、VitB6的水平 (n=8,±s)

表1 精神分裂癥組和正常對照組血漿 H2S、Hcy、葉酸、VitB6的水平 (n=8,±s)

注:與正常對照組比較*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 2.2 精神分裂癥組血漿 H2S水平與 Hcy、葉酸、VitB6水平的關系 直線相關分析顯示,血漿 H2S水平與 Hcy水平呈負相關 (r=-0.7214,P＜0.001),與血漿葉酸及 VitB6水平呈正相關(r=0.5189,P ＜0.001;r=0.4299,P ＜0.05)。

組 別 H2S(μ mol/L)Hcy(μ mol/L)葉酸(μ g/L)VitB6(μ g/L)研究組 33.89± 7.72** 21.39± 8.21*** 4.57± 2.15** 12.25± 5.56*對照組 56.17± 11.64 10.05± 3.29 7.70± 2.18 23.17± 6.61

3 討 論

PCP作為一類精神活性物質,具有與苯丙胺(AM P)類所致精神障礙不同,既有幻覺妄想等陽性癥狀,又有情感淡漠、意欲減退等陰性癥狀。它不僅能在正常人身上誘發注意缺陷,運動功能失調、本體感覺障礙、象征性思維,也能使精神分裂癥患者原有的精神癥狀惡化[5]。

內源性 H2S是由 Hcy代謝產物之一半胱氨酸在 CBS、CSE或半胱氨酸轉移酶的催化下產生的,腦內產生 H2S的主要酶是 CBS。在 Hcy的代謝過程中,當機體蛋氨酸充足時,Hcy通過轉硫化途徑合成胱硫醚,后者在 CSE作用下被代謝為半胱氨酸、α-酮丁酸和 H2S等[6]。另外,不同于大多數文獻的報道,Chen等[7]研究發現 CBS催化生成 H2S的主要機制不是通過半胱氨酸水解產生,而是通過半胱氨酸和同型半胱氨酸的置換反應實現的,這個途徑產生 H2S的量至少是通過半胱氨酸水解產生的 H2S的 50倍。以上觀點雖還有待進一步的研究證實,但都提示 H2S和 Hcy可能存在著內源性的相互調節作用。

本研究結果表明,精神分裂癥大鼠血漿 H2S的水平顯著低于正常對照組,而血漿 Hcy水平明顯高于正常對照組(P＜0.01,P＜0.001)。內源性 H2S是半胱氨酸的代謝產物,而Hcy被認為是精神分裂癥的一個危險因素,它們都與 CBS表達及活性相關。由此推測,精神分裂癥大鼠血漿中 Hcy水平增高及 H2S水平降低,均可能由于 CBS酶活性的改變或缺乏。精神分裂癥大鼠血漿中 H2S水平降低有什么意義呢?現有基礎研究表明,生理濃度的 H2S可易化海馬長時程增強,參與學習和記憶機制[8];具有抗氧化損傷的作用,能保護神經元免受興奮性氨基酸(谷氨酸)、過氧化亞硝基和次氯酸導致的氧化應激[9-12]。

目前研究非常明確的是,Hhcy多是由于缺乏 Hcy代謝過程中的輔助因子葉酸及 VitB6所引起的,并且通過補充葉酸、VitB12及VitB6可以降低血漿 Hcy濃度。本研究同樣也發現精神分裂癥大鼠血漿葉酸及 VitB6水平明顯低于正常對照組,與當前國內外的研究結果相符[13]。VitB6參與 Hcy代謝的轉硫途徑 ,Hcy在 CBS作用下,以 VitB6為輔酶 ,與絲氨酸縮合為胱硫醚,最終裂解為α-酮丁酸、半胱氨酸,后者再由CBS或 CSE催化生成 H2S。本研究結果表明,血漿 H2S水平與血漿葉酸及 VitB6水平呈正相關(r=0.5341,P＜0.01;r=0.4615,P＜0.05);故缺乏 VitB6時,體內 H2S水平也會降低。因此,推測通過補充 VitB6可提高血漿 H2S水平,從而降低精神分裂癥的患病危險。此推論需要臨床觀察研究證實。

本研究檢測血漿中 H2S水平,由于取材局限不能直接檢測腦組織中 H2S水平,雖然 H2S在外周和中樞的代謝途徑存在區別,但是 H2S是脂溶性氣體小分子物質,可快速通過血腦屏障和血管內皮細胞,因此血漿中 H2S水平在一定程度上反映了腦組織中 H2S的水平。由于研究方法和樣本量的不同所導致的相關研究中報道的血漿中 H2S和 Hcy值的差別。

H2S是新近發現的新型氣體信號分子,在神經系統、心血管系統等均發揮重要的生理作用,本研究發現精神分裂癥大鼠血漿中 H2S含量降低,低水平的 H2S是否是精神分裂癥的危險因素,非常值得進一步的研究探討。

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