ERK1／2在大鼠心肌缺血預處理中的作用

馬彩云，李遠征，杜鳳和

1986年 Murry等［1］首次提出了缺血預處理 （ischemic preconditioning，IPC）的概念：預先反復短暫缺血再灌注（ischemia／reperfusion，I／R）可以提高心肌組織對隨后較長時間缺血的耐受性。IPC是迄今為止對心肌保護作用最強的機體內源性保護機制。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）家族在細胞分化、發育、存活及死亡等生理過程中發揮著重要的作用。細胞外信號調節的蛋白激酶（extracellular signal regulated protein kinases，ERK）是 MAPK家族重要成員之一。ERK轉導通路不僅涉及心肌細胞的信號轉導、生長等生理過程，而且與心肌細胞的肥厚和凋亡等病理過程密切相關。ERK在IPC中的變化及意義仍存在爭議。本研究旨在觀察IPC對大鼠缺血再灌注心律失常和心功能的影響以及ERK1／2在IPC中的作用，從而探討缺血預處理的保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠16只，體重150g～180g，由首都醫科大學實驗動物部提供；抗－磷酸化 MAPK（Thr202／Thy204）購自美國Promega公司；羊抗兔IgG抗體－辣根過氧化物酶標記購自北京中山公司；Western－Blotting發光試劑盒購自美國Santa Cruz。

1.2 方法 所有動物均為自由飲水、自由攝食。8周后，戊巴比妥鈉（45mg／kg）腹腔注射麻醉。氣管插管連接動物人工呼吸機。結扎和松開冠狀動脈左前降支復制心肌I／R模型；采用缺血5min／再灌注5min兩次造成IPC。用四導生理記錄儀持續監測標準肢體導聯（Ⅱ）導的心電圖，并通過高速數據采集卡輸入計算機。參考Cutis和Raringgervoa等［2，3］的標準對心律失常進行評分。0分：無心律失常或僅有室性早搏（＜5次）；1分：僅有室性早搏（≥5次）；2分：僅有一陣室性心動過速（＜60 s）；3分：一陣心動過速（≥60s）或多陣心動過速（累積＜60s）；4分：多陣心動過速（累積≥60s）；5分：出現室顫（非不可逆性）；6分：出現不可逆性室顫或死亡。實驗結束后，迅速取出心臟置液氮中，采用Western－blotting分析方法檢測心肌中ERK1／2的磷酸化表達。

1.3 實驗分組 IPC組：大鼠手術后經缺血5min／再灌注5 min兩輪后，給予缺血60min／再灌注30min處理后取心臟；I／R組：大鼠經手術后觀察20min，然后給予缺血60min／再灌注30min處理后取心臟。

1.4 統計學處理 采用SPSS14.0統計軟件包處理。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗。

2 結 果

缺血60min及再灌注期間，IPC組心律失常評分顯著低于I／R組（P＜0.01）；IPC組大鼠心肌ERK1／2磷酸化表達明顯高于I／R組。詳見表1和圖1。

表1 兩組大鼠缺血／再灌注期心律失常評分及ERK1、ERK2的磷酸化表達（x±s）

3 討 論

圖1 大鼠心肌ERK1／2的磷酸化表達

本實驗以在體大鼠模型研究IPC現象，發現在短陣IPC后，再給予缺血再灌注處理時，IPC組大鼠缺血再灌期的心律失常評分較IR組顯著降低，說明IPC能夠減輕大鼠缺血再灌注心律失常的嚴重程度，這與既往的研究結果一致［4］。近年來，以受體激活為起點，以細胞內信號轉導為主線構成IPC保護機制研究的重點。MAPK是信號從細胞表面傳導到細胞核內部的重要傳遞者。ERK是MAPK家族成員之一，至少包含ERK1和ERK2兩個亞型。它的信號傳遞途徑是涉及調劑細胞生長、發育和分裂的信號網絡中心，其基本的信號傳遞步驟是：Ras－Raf－MEK－ERK。目前多數研究表明ERK1／2的激活參與IPC的保護作用。Schaper等的研究發現，用ERK的抑制劑PD098059能夠消除豬IPC誘導的早期保護作用，而預處理期間ERK1和ERK2的活性升高，表明ERK參與IPC的心臟早期保護作用［5］。Choid等［6］研究表明 ERK1／2激活可能是大鼠海馬神經元IPC保護作用的機制之一。近年我國也有學者研究指出ERK－MAPK信號轉導通路在IPC過程中能夠通過抑制Rho－激酶的活性從而減弱大鼠缺血／再灌注引起的心肌細胞凋亡［7］。這與本實驗研究結果一致。也有研究不支持ERK參與IPC的保護作用。Kim等的研究表明IPC引起的早期保護中，ERK1的激活是暫時的，并不參與IPC引起的心肌梗死面積的減少［8］。而Namura等的［9］研究結果顯示ERK介導了神經元的死亡。這可能與動物的種屬和實驗模型有關。

總之，本研究結果表明IPC組大鼠心肌ERK1／2表達明顯高于IR組，提示ERK1／2激活可能是IPC心肌保護作用的產生機制之一。

［1］ Murry CE，Jennings RB，Reimer KA.Preconditioning with ischemia：A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium［J］.Circulation，1986，74（5）：1124－1136.

［2］ Curtis MJ.Model for the study of arrhythmias in the myocardial ischemia and infarction：The use of the rat［J］.J Mol Cell Cardiol，1987，19：399－419.

［3］ Ravingerova T.Intermediate and prolonged ischemia in the isolated crystalloid perfused rat heart：Relation between susceptibility to arrhythmias and degree of ultrastructural injury［J］.J Mol Cell Cardiol，1995，27：1937－1951.

［4］ 馬彩云，張立克，杜鳳和，等.細胞外信號調節的蛋白激酶對糖尿病大鼠心肌缺血預處理的影響［J］.中國病理生理學雜志，2005，21（1）：68－71.

［5］ Strohm C，Barancil M，Brahl M，et al.Inhibition of ER－Kinase cascade by PD 098059and U 0126counteracta ischemic preconditioning in pig myocardium［J］.Cardiovascular Research，2000，36：218－229.

［6］ Choid JS，Kim HY，Cha JH，et al.Ischemic preconditioning－induced activation of ERK1／2in the rat hippocampus［J］.Neurosci Lett，2006，409（3）：187－191.

［7］ Zhang J，Bian HJ，Li XX，et al.ERK－MAPK signaling opposes rho－kinase to reduce cardiomyocyte apoptosis in heart ischemic preconditioning［J］.Molecular Medicine，2010，16（7－8）：307－315.

［8］ Ryan M，Fryer AK，Hsu GJ，et al.ERK and P38MAP kinase activation are components of opioid－induced delayed cardioprotection［J］.Basic Research in Cardiology，2001，96（2）：136－142.

［9］ Namura S，Lihara K，Takami S，et al.Intravenous administration of MEK inhibitor U0126affords brain protection against forebrain ischemia and focal cerebral ischemia［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，12：3487－3491.