急性冠脈綜合征患者外周血單個核細胞miR－146a表達及其與炎癥因子的相關性研究

郭 敏，閆 蕊，呂吉元，范春雨

目前多數學者認為動脈粥樣硬化（AS）是在大、中動脈血管壁內皮細胞損傷后細胞免疫所接到的慢性炎癥反應［1］。隨著對動脈粥樣硬化發病機制及危險因素的深入了解和積極控制，慢性心血管病的一級預防取得了令人鼓舞的進展，然而急性心血管事件（包括心臟性猝死和急性冠狀動脈綜合征）的預防及治療仍缺乏有效的措施。近年研究發現，導致急性心血管病事件的主要原因是AS斑塊的易損性，而炎癥在易損斑塊發生機制中的核心作用日益受到重視［2］。

MicroRNA是一組最近發現的內源性的非蛋白編碼調控RNA，這些含有19個～23個核苷酸單鏈RNA可以通過與靶基因mRNA的3’UTRs不同程度的互補結合，以降解靶基因mRNA或抑制翻譯兩種方式調節生物體內基因的表達［3］。晚近研究提示，MicroRNA（miR－146a）在T細胞、B細胞、單核細胞中均有表達，并與多種炎癥因子及轉錄因子的活性有密切關系，在免疫反應中miR－146a可能發揮了精細的調控作用［4］。本研究通過對急性冠脈綜合征患者外周血單個核細胞內miR－146a表達水平的檢測及其與炎癥因子相互關系的探討，為miR－146a在ACS中的基礎研究奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2011年7月—2012年2月在我院住院及門診隨訪的患者91例，其中急性心肌梗死（AMI）26例，不穩定型心絞痛（UA）25例，穩定型心絞痛（SA）22例，胸痛綜合征（CPS）18例，所有患者均行冠狀動脈造影檢查。CPS組為胸痛但不伴有心電圖改變和冠狀動脈狹窄及痙攣［5］。

排除標準：合并嚴重的肝腎功能不全；心臟或其他部位的急、慢性炎癥；合并腦卒中；惡性腫瘤；風濕性疾病；高熱以及應用炎癥抑制藥物如非甾體類抗炎藥、類固醇及鴉片類藥物等。

1.2 研究方法

1.2.1 血樣采集 AMI與UA患者均在發病24h內從前臂周圍靜脈采取空腹血標本，SA組和CPS組于冠狀動脈造影時采血3mL，肝素鈉抗凝。

1.2.2 Real－time PCR法檢測 miR－146amRNA的表達 淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞（PBMC），用 miReasy Mini Kit試劑盒提取＜200bp RNA，每組設10μL RT反應體系采用miScript Reverse Transcription Kit試劑盒進行逆轉錄反應，取5μL cDNA模板采用the miScript Primer Assay及the miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒進行PCR。miR－146a擴增應用 miScript通用引物及其特異性引物（5′－UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU－3′the miScript Primer Assay），同時以5S作為內參（上述試劑盒均購自QIAGEN公司，所用操作步驟均按照說明書進行），應用ABI7500實時定量PCR儀測定其相對表達量。

1.2.3 Northern blot法驗證miR－146amRNA表達 分別提取各組細胞總RNA各100μg，用8M尿素變性的15%聚丙烯酰胺凝膠分離，并用半干式轉移系統轉移至尼龍膜，紫外交聯固定。預雜交后，加入地高辛標記的探針，42℃雜交24h。經洗膜、曝光與放射自顯影后觀察，所用的寡核苷酸探針為miR－146a：U6：5′－CTCGCTTCGGCAGCAGCACA－3′。

1.2.4 ELISA法檢測培養基上清炎癥因子的表達 分離的PBMCs用含10%小牛血清的RPMI1640調整細胞濃度為2×106／mL，加入植物血凝素（PHA）5ng／mL濃度，置于37℃，5%CO2培養箱培養48h后，收集上清儲存于－20℃用于細胞因子：腫瘤壞死因子（TNF－α）、γ干擾素（IFN－γ）、白介素－10（IL－10）檢測。

1.3 統計學處理 所有資料均以均數±標準差（x±s）表示，應用SPSS13.0軟件進行統計學分析，行方差齊性檢驗，多個均數比較用單因素方差分析，兩個均數比較用t檢驗。P＜0.05為有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組臨床資料比較（見表1） 4組患者的年齡、血脂均無統計學意義（P＞0.05）。

表1 4組患者年齡、血脂比較（x±s）

2.2 Real－time PCR和Northern blot檢測 miR－146amRNA結果（見表2）

表2 各組miR－146amRNA檢測結果（x±s） %

2.3 PBMCs培養基上清中細胞因子檢測結果 與SA組及CPS組相比，AMI及UA組TNF－α、IFN－γ表達明顯升高（P＜0.01），IL－10則無顯著變化（P＞0.05）。SA組及CPS組間和AMI及UA組間各個細胞因子間差異均無統計學意義（P＞0.05）。詳見表3。

表3 PBMCs培養基上清中細胞因子檢測結果（x±s）ng／mL

2.4 miR－146a與炎癥因子的相關性 miR－146a與TNF－α（r＝0.612，P＜0.01）、IFN－γ（r＝0.573，P＜0.01）呈顯著正相關，而與IL－10無顯著相關性（r＝0.166，P＞0.05）。

3 討 論

ACS是不穩定冠狀動脈粥樣斑塊發生破裂繼發完全或不完全閉塞性血栓形成、血管痙攣而引起的一系列急性和亞急性心肌缺血的臨床綜合征。臨床表現為不穩定型心絞痛和急性心肌梗死。炎癥反應在ACS不穩定斑塊的發生、發展及最終破裂過程中起著至關重要的作用。因此，參與ACS不穩定斑塊破裂的炎癥因子及其調節機制對防治急性冠脈綜合征至關重要。

晚近研究發現，microRNA是一種存在于各種生物體內的具有廣泛調節細胞代謝、增殖、凋亡、分化和發育的微小RNA。到目前為止，在人類基因組中已發現數百種MicroRNA，它們有可能對人類基因組中近30%的基因發揮調控作用［6］。已有研究發現，眾多miRNA和靶基因之間形成復雜的功能網絡，在免疫反應強度、時效性、細胞分化和功能調節等環節均可發揮精細調節作用［7］。晚近研究發現，miR－146a在銀屑病皮損部位和類風濕性關節炎病變部位的滑膜細胞。巨噬細胞、T細胞及B細胞中表達均增加，提示miR－146a參與了慢性炎癥的病理過程［7］。Taganov等［8］研究也發現在 LPS刺激后的單核細胞中miR－146a的表達增加，炎癥因子TNF－α、IL－1β也可以通過NF－κB依賴的途徑誘導miR－146a表達上調，從而提出miR－146a可能是免疫炎癥反應的關鍵調節因子。而以往大量研究證實，動脈粥樣硬化疾病，風濕性關節炎及銀屑病都是Th1細胞功能亢進而導致的器官特異性自身免疫疾病，可能有類似的免疫調節機制。本研究發現miR－146a在ACS患者中的表達較之CPS及SA患者中的表達明顯增高，提示miR－146a可能參與了ACS的斑塊炎癥反應，最終導致臨床心血管事件的發生。

TNF－α和IFN－γ是具有廣泛生物學特性的多肽調節因子，在介導免疫和炎癥反應過程中起重要作用，二者在AS中大量表達，它們可以誘導自身表達及使其他細胞因子及黏附分子表達增加；損傷內皮細胞，刺激血管平滑肌增殖和收縮，促進AS斑塊形成和斑塊損傷處血管痙攣收縮；誘導巨噬細胞的凋亡等，從而促進了斑塊的破裂，導致了ACS的發生。IL－10被認為是一種免疫抑制因子，可抑制單核巨噬細胞及T淋巴細胞合成炎癥因子，減慢AS進程，也有研究證明IL－10在外周血中有抑制組織因子的作用，從而在AS進程中發揮抗炎、抗栓作用，起到穩定斑塊，防治ACS發生的作用。本研究發現在ACS患者PBMC培養上清中促炎因子TNF－α和IFN－γ明顯增高，抗炎因子IL－10變化不明顯，并進一步發現miR－146a的表達與TNF－α和IFN－γ呈明顯正相關，提示miR－146a可能是通過促進致炎因子的表達，促進ACS的發生發展。

綜上所述，miR－146a可能在ACS的免疫反應中發揮積極的作用，從而可以成為ACS基因治療的新靶點，將在下一步的研究中通過體外干預miR－146a表達，進一步探討其在免疫反應中的調節機制，從而為ACS的臨床防治提供一個新的靶點。

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［3］ Bartel DP.MicroRNAs：Genomics，biogenesis，mechanism，and function［J］.Cell，2004，116：281－297.

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［6］ Lewis BP，Burge CB，Barrel DP.Conserved seed pairing，often flanked by adenosines，indicates that thousands of human genes are microRNA targets［J］.Cell，2005，120（1）：15－20.

［7］ Sonkoly E，Wei T，Janson PC，et al.MicroRNAs：Novel regulators involved in the pathogenesis of psoriasis［J］.PLoS ONE，2007，2（7）：e610.

［8］ Taganov KD，Boldin MP，Chang KJ，et al.NF－kappaB dependent induction of microRNA miR－146，an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（33）：12481－12486.