復合益生菌芽孢桿菌發酵培養基及條件的優化

張媛媛 趙 敏 張 寧

(東北林業大學，哈爾濱，150040)

社會呼喚綠色、安全的食品，而飼料安全更是食品安全的前提。有理由相信，動物飼料中大量使用益生菌制劑的時代已經來臨［1］。芽孢桿菌制劑是一種常用高效益生菌添加劑。枯草芽孢桿菌作為芽孢桿菌屬的模式種具有很多優點，包括耐酸、耐鹽、耐高溫(100℃)及耐擠壓等特性，因而在飼料的加工、貯藏以及通過動物胃腸道酸性環境等的過程中具有較高的穩定性［2］。此外它還具有很強的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，對植物性碳水化合物具有較強的降解能力，可促進機體對食物的消化吸收［3］。而凝結芽孢桿菌更是一種具有廣闊發展前景的益生菌，它不但具有芽孢桿菌的優點，更兼具乳酸菌的特性，有效地添補了乳酸菌制劑和雙歧桿菌制劑耐性差、培養及儲存條件苛刻等方面的缺陷［4－5］。Adami and Cavazzoni［6］發現，凝結芽孢桿菌對仔豬糞中的微生物區系有明顯的影響，且這種益生菌有利于改善動物的生產性能。因此，本研究選取二者進行聯合培養，充分考慮到二者的共性和特性，培養基配方也采用了成本低廉且適用于工業生產的發酵原料，以期在動物飼養中獲得更顯著的效果并帶來更可觀的經濟效益。

1 材料

菌種 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtili)1.892，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心;凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)1.200 9，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

培養基 種子培養基:蛋白胨10 g/L，酵母浸出物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH=7.2 ～7.5，121 ℃滅菌20 min。

發酵培養基:葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 4 g/L，pH=7.2 ～7.5，121 ℃滅菌20 min;計數培養基:LB瓊脂培養基。

主要試劑 工業用廢糖蜜(哈爾濱英瑞斯飼料有限公司提供，含糖量為570 g/L)，玉米粉(市售，GB/T 8885—2008)，豆粕粉(哈爾濱英瑞斯飼料有限公司提供，含氮量為76.3 g/L)，玉米漿(哈爾濱英瑞斯飼料有限公司提供，含氮量35.8 g/L)，瓊脂(生物試劑，北京索來寶科技有限公司);葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖、乳糖、尿素、NH4Cl、OXOID酵母浸粉(生物試劑，北京鴻潤寶順科技有限公司)、蛋白胨、MgSO47H2O、KH2PO4、K2HPO4、NaCl、CaCO3、氯化鈣(均為分析純，天津市北方天醫化學試劑廠)。

儀器設備 FLC—3CLEAN BENCH超凈工作臺(哈爾濱市東聯公司)，DGX—9243B—1電熱鼓風干燥箱(上海?，攲嶒炘O備有限公司)，HZQ—F160型振蕩培養箱(哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司)，MLS—3020高壓滅菌鍋(SANYO Electric Co.Ltd.)，HAIER BCD—237F電冰箱(青島海爾電冰箱股份有限公司)，HZQ—F160A型恒溫培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)，PHS—3S精密PH計(上海精密科學儀器有限公司)。

2 試驗方法

2.1 培養方法

①菌種活化:將保存于斜面的兩株菌種分別轉接到新鮮的LB斜面培養基上，37℃培養18 h，置于冰箱中4℃保存，備用。

②種子液的制備:取20 mL種子培養基于100 mL三角瓶中，滅菌后各接入一環活化的菌種，37℃、150 r/min條件下培養18 h。

③搖瓶發酵培養:取100 mL發酵培養基于250 mL三角瓶中，滅菌后接入兩種芽孢桿菌各1.5 mL(總接種量為3%)。將三角瓶置37℃、150 r/min振蕩培養24 h。

2.2 培養基成分的單因子試驗

碳源:分別用20 g/L的廢糖蜜、玉米粉、可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖、乳糖、廢糖蜜+玉米粉(m(廢糖蜜)∶m(玉米粉)=1∶1)等量替代基礎發酵培養基中的葡萄糖，制成培養基進行發酵培養。24 h后檢測活菌數，確定最佳碳源。

氮源:分別用10 g/L的尿素、豆粕粉、NH4Cl、酵母浸粉、豆粕粉+NH4Cl(m(豆粕粉)∶m(NH4Cl)=1∶1)、玉米漿、(NH4)2SO4等量替代基礎發酵培養基中的蛋白胨，制成培養基進行發酵培養。24 h后檢測活菌數，確定最佳氮源。

無機鹽:分別用4 g/L的硫酸鎂、磷酸二氫鉀(2 g/L)+磷酸氫二鉀(2 g/L)、氯化鈣、硫酸亞鐵、碳酸鈣等量替代基礎發酵培養基中的氯化鈉，制成培養基進行發酵培養。24 h后檢測活菌數，確定最佳無機鹽。

最佳碳源質量濃度:在確定最佳氮源和最佳無機鹽的含量不變的條件下，分別取質量濃度為10、20、30、40、50、60 g/L 的碳源進行搖瓶發酵培養，24 h后檢測活菌數，以確定最佳碳源的質量濃度。

最佳氮源質量濃度:在確定最佳碳源和最佳無機鹽的含量不變的條件下，分別取質量濃度為10、20、30、40、50、60 g/L 的氮源進行搖瓶發酵培養，24 h后檢測活菌數，以確定最佳氮源的質量濃度。

最佳無機鹽質量濃度:在確定最佳碳源和最佳氮源的含量不變的條件下，分別取質量濃度為2、4、6、8、10、12 g/L 的無機鹽進行搖瓶發酵培養，24 h 后檢測活菌數，以確定最佳無機鹽的質量濃度。

上述各試驗均作3次重復，結果取平均值。

2.3 正交試驗

將單因子試驗篩選出的最佳碳源、氮源、無機鹽，按照L9(3)4正交表設計正交試驗進一步優化，每試驗進行3次重復。正交試驗因素及其水平見表1。

表1 L9(34)正交設計因素表 g·L－1

2.4 發酵條件的優化

采用正交試驗優化出的培養基配方，在保證發酵過程中其他發酵條件不變的情況下，對最佳培養時間、溫度、初始pH值、轉速、接種量、裝液量進行逐一優化。每一試驗進行3次重復，結果取平均值。

采用平板稀釋涂布法［7］進行活菌計數。

采用正交設計助手II對數據進行處理。

3 結果與分析

3.1 發酵培養基成分的優化

3.1.1 不同碳源對復合益生菌芽孢桿菌生長的影響

以m(廢糖蜜)∶m(玉米粉)=1∶1的比例混合發酵時，復合益生菌芽孢桿菌的活菌數最高，達到7.71×109CFU/mL;其次是廢糖蜜，活菌數達 6.43×109CFU/mL，二者均高于基礎碳源葡萄糖的活菌數為6.04×109CFU/mL;而其余碳源的活菌數均低于基礎碳源葡萄糖(表2)。廢糖蜜、玉米粉作為碳源不但活菌數高且價格低廉，發酵成本低，適用于規?；a。

3.1.2 不同氮源對復合益生菌芽孢桿菌生長的影響

豆粕粉作為氮源時，復合益生菌芽孢桿菌的活菌數最高，達到6.06×109CFU/mL;其次是基礎氮源蛋白胨，活菌數達5.74×109CFU/mL(表2)。其中，無機氮源的活菌數均明顯低于有機氮源，可見芽孢桿菌對有機氮源的利用率更高，更適合其生長。選擇復合芽孢桿菌生長的最佳氮源為豆粕粉。

3.1.3 不同無機鹽對復合益生菌芽孢桿菌生長的影響

分別以m(磷酸氫二鉀)∶m(磷酸二氫鉀)=1∶1和氯化鈣作為無機鹽發酵時，活菌數均高于基礎無機鹽氯化鈉，前兩者活菌數分別為5.63×109CFU/mL和 5.02×109CFU/mL，而氯化鈉為 4.96×109CFU/mL(表2)。其他無機鹽活菌數均小于氯化鈉。故選擇m(磷酸氫二鉀)∶m(磷酸二氫鉀)=1∶1和氯化鈣作為最佳無機鹽。

表2 不同培養基成分對復合益生菌芽孢桿菌生長的優化結果

3.1.4 最佳碳源的不同質量濃度對復合益生菌芽孢桿菌生長的影響

最佳碳源的不同質量濃度對復合芽孢桿菌的生長存在一定的影響，選擇質量濃度低的碳源時，隨著質量濃度的逐漸增加，活菌數也不斷提高，當質量濃度達到3%時，活菌數最高，為5.66×109CFU/mL。其后隨著最佳碳源不同質量濃度的進一步提高，活菌數逐步緩慢下降并趨于平穩(表3)。故選擇3%時的碳源為最佳碳源含量。

3.1.5 最佳氮源的質量濃度對復合益生菌芽孢桿菌生長的影響

當氮源的質量濃度較低時，對復合芽孢桿菌活菌數的影響并不明顯，但隨著氮源質量濃度的不斷提升，當氮源的質量濃度達到4%時，芽孢桿菌活菌數提高到1.02×1010CFU/mL之后緩慢遞減(表3)。故選擇4%時的氮源為最佳氮源含量。

3.1.6 最佳無機鹽的質量濃度對復合益生菌芽孢桿菌生長的影響

最佳無機鹽所選取的6種不同的質量濃度對復合芽孢桿菌活菌數的影響并不顯著，均能達到6.0×109CFU/mL左右。隨著最佳無機鹽質量濃度的逐漸增大，活菌數基本保持平穩，變化幅度不大(表3)，故選取最低的質量濃度為0.2%的最佳無機鹽便可以滿足芽孢桿菌正常的生長代謝。

表3 最佳碳源、氮源、無機鹽的不同質量濃度對復合益生菌芽孢桿菌生長的優化結果

3.1.7 正交試驗

對單因子試驗優化出來的各營養成分做進一步優化，采用L9(3)4正交表進行正交試驗，以期找到培養基成分中碳源、氮源、無機鹽之間的最佳配比，結果見表4。

表4 培養基優化正交試驗表

正交試驗優化出的最佳組合為A2B2C1D2，由于該組合并不在以上正交試驗所列的9次試驗范圍內，故對正交試驗得出的最優組合進行了驗證性試驗，試驗結果顯示:對A2B2C1D2組合的3次試驗結果取平均值，活菌數達6.370×1010CFU/mL，高于9次試驗中的最高活菌數5.931×1010CFU/mL。故復合芽孢桿菌的最佳培養基配方為廢糖蜜15 g/L、玉米粉 15 g/L、豆粕粉 40 g/L、KH2PO41 g/L、K2HPO41 g/L、氯化鈣2 g/L。極差分析得 RA＞RB＞RC＞RD，可知各因素對復合芽孢桿菌活菌數的影響大小依次為:廢糖蜜＞豆粕粉＞磷酸鹽＞氯化鈣。對正交試驗的方差分析表明(表5)，廢糖蜜、豆粕粉為顯著影響因子，無機鹽為不顯著影響因子，故選取較低質量濃度的無機鹽方可滿足益生菌生長的需求。

表5 正交試驗方差分析結果

3.2 發酵條件的優化

3.2.1 生長曲線的測定

按試驗確定的最佳培養基配方對種子進行搖瓶發酵培養，培養時間為32 h。自接種后每2 h取樣1次測定菌液的OD600nm，未接種的培養基作為空白對照，結果見圖1。由圖1可知，種子液接入發酵培養基后，0～6 h為生長的延滯期;6～16 h為對數期，菌體數量急劇增多;18 h以后為芽孢桿菌的相對穩定期。可見復合芽孢桿菌的最佳培養時間應選在18～26 h之間。

圖1 復合益生菌芽孢桿菌的生長曲線

3.2.2 初始溫度對復合益生菌芽孢桿菌生長的影響

溫度主要通過改變酶反應速率來影響菌體的生長。隨著培養基溫度的升高，酶促反應的速率也隨之增大，代謝水平加快。但溫度過高會引起酶類失活，表現為菌體迅速衰老，導致活菌數大幅度降低，影響產量。試驗選取25、30、35、40、45、50 ℃作為搖床溫度，搖瓶發酵培養24 h，運用平板稀釋涂布法進行活菌計數，確定不同溫度對復合芽孢桿菌生長的影響。試驗結果表明，溫度為35～40℃時，活菌數較高，且以37℃時為最高，活菌數可達3.73×1010CFU/mL(表6)。

3.2.3 初始pH值對復合益生菌芽孢桿菌生長的影響

pH值主要通過影響菌體細胞膜電荷、膜滲透性以及營養物質離子化的程度，從而影響菌體對養分的吸收。由于搖瓶過程中的pH值難以控制，只能控制發酵液的初始pH值。因此本試驗將最佳培養基配方的初始 pH 分別調至 4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5，搖瓶發酵培養24 h后測其活菌數。復合芽孢桿菌在初始pH值為7.0～8.0范圍內的活菌數較高，且以pH=7.5時為最高，活菌數可達5.69×1010CFU/mL(表6)。

3.2.4 接種量對復合益生菌芽孢桿菌生長的影響

接種量的多少與菌株生長周期的長短有關，不同接種量對復合芽孢桿菌活菌數影響較大，接種量過高或過低均會影響活菌數的水平。接種量低，延滯期過長，造成培養周期延長，耗費大量時間;接種量高，細菌對營養成分的競爭力過大，造成菌體因營養供應不足而提前死亡，同樣會抑制活菌數的提高，故試驗選取2%、4%、6%、8%、10%、15%的接種量進行接種，搖瓶發酵培養24 h后測其活菌數。接種量為8%時，復合芽孢桿菌的活菌數達最高，為3.42×1010CFU/mL(表6)?？梢姀秃涎挎邨U菌的最佳接種量為8%。

表6 不同發酵條件對復合芽孢桿菌生長的優化結果

3.2.5 裝液量對復合芽孢桿菌生長的影響

裝液量的大小主要反映搖瓶內溶氧量的多少，裝液量越小，瓶內溶氧則越多。在250 mL三角瓶中分別裝入最佳培養基，使得裝液量分別為30%、35%、40%、45%、50%、55%，搖床發酵培養24 h后測其活菌數。采用40%的裝液量時活菌數最高，為3.84×1010CFU/mL，但隨著裝液量的增大，活菌數不斷下降(表6)?？梢娙苎跛皆礁?，則越適合需氧的復合芽孢桿菌生長。在實際生產中，可以根據實際情況，酌情掌握裝液量的大小，盡可能使溶氧量增加。

3.2.6 搖床轉速對復合芽孢桿菌生長的影響

不同搖床轉速對復合芽孢桿菌發酵的活菌數存在一定的影響。隨著搖床轉速的增大，活菌數得到顯著提高，當轉速達到160 r/min時，活菌數達到最高，為 4.53×1010CFU/mL(表6)，但進一步提高搖床轉速，活菌數則開始逐漸下降，可能由于轉速過高會加快細菌菌體的裂解所致。故選定160 r/min為復合芽孢桿菌發酵培養的搖床轉速。

4 結論

采用單因子試驗及正交試驗，在搖瓶中對復合芽孢桿菌的培養基成分進行優化，通過平板稀釋涂布法測定培養24 h后的活菌數，以活菌數的高低作為評價指標，得到最優培養基配比為:廢糖蜜15 g/L、玉米粉 15 g/L、豆粕粉 40 g/L、KH2PO41 g/L、K2HPO41 g/L、氯化鈣2 g/L。通過單因子試驗確定了最佳培養條件［8］為:起始 pH=7.5、溫度 37 ℃、接種量8%、裝液量40%、搖床轉速160 r/min。通過對復合芽孢桿菌培養基及培養條件的優化后，活菌數得到顯著提高，達到6.62×1010CFU/mL。明顯高于崔東良等［9］對單株凝結芽孢桿菌工業化發酵培養基初步研究所得的活菌數9.3×109CFU/mL，且成本低廉，更適合于工業化生產。

本試驗僅是在實驗室搖床培養條件下進行的優化，還需在生產用發酵罐中做進一步驗證。對于實際生產中各項發酵參數的設定，也需要做更詳盡的研究。

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