不同品種山葡萄果皮和酒中非花色苷酚的成分分析1)

趙 權

(吉林農業科技學院，吉林，132101)

王 軍

(中國農業大學)

楊成君

(東北林業大學)

酚類物質是葡萄漿果中一種重要的次生代謝產物，對葡萄漿果和葡萄酒的感官質量有重要影響，尤其對紅葡萄酒的色澤、苦味、收斂性、澄清度和穩定性等起重要作用［1－3］。前人研究表明，酚類物質具有防癌抗癌［4－7］、免疫調節活性［8］、預防心腦血管疾病［9］、抗疲勞［10］、抗過敏及抗炎、改善視覺功能［11］、保護肝臟、清除自由基、抗突變、降低血清膽固醇等作用［12］。非花色苷酚類物質是指除花色苷以外的酚類物質，包括苯甲酸類、肉桂酸類、黃烷－3－醇類、黃酮醇類、白藜蘆醇類。這些物質在葡萄酒發酵及陳釀過程中的變化極其復雜，對葡萄酒的質量有很大的影響［13－15］。葡萄漿果中含有大量非花色苷酚類物質，主要分布于果皮、種子和果梗中，在葡萄酒釀造過程中這些物質被浸漬到葡萄酒中。山葡萄(Vitis amuremsis Rupr.)是東北地區釀造葡萄酒的主要原料，山葡萄酒具有甜酸可口、濃郁醇厚、余味綿長之特點，長期飲用可促進血液循環，消除疲勞，增強體質［16］。目前，國內外對歐亞葡萄果皮及酒非花色苷酚的種類、質量分數等研究較多［17－21］，但是對山葡萄的研究較少，特別是對山葡萄果皮和酒中非花色苷酚種類和質量分數的研究未見報道。

本研究以7個山葡萄品種為材料，利用HPLCMS/MS技術對山葡萄果皮和酒中非花色苷酚種類及質量分數進行分析，探討不同品種山葡萄果皮和酒中非花色苷酚的組成及質量分數的差異及特點，研究結果將為山葡萄酒的加工以及品種選育提供理論依據。

1 材料與方法

以山葡萄左山一、左山二、左紅一、左優紅、雙豐、雙紅、雙優7個品種為試驗材料，于2008年9月份采自中國農業科學院特產研究所國家山葡萄種質資源圃。果實為商品成熟期，左山一、左山二、雙豐采摘時期為9月8日;左紅一、左優紅、雙紅、雙優采摘時期為9月10日。

流動相甲醇(HPLC)、乙腈(HPLC)、冰醋酸(HPLC)均購于 Fisher公司(Fairlawn，NJ，USA)，采用 Milli－Q(Milipore，Bedford，MA)系統制備的超純水。標準樣品沒食子酸、兒茶素、咖啡酸、白藜蘆醇、槲皮素均由 Sigma(Chemical Co.，St.Louis，USA)公司購買。

KG2200B型超聲波清洗器;RE－52AA型旋轉蒸發器;SHZ－III型循環水真空泵。Agilent 1200系列LC/MSD離子阱液相色譜—質譜聯用儀、G1379A真空溶劑脫氣機、G1311A四元高壓梯度泵、G1313A自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1315A二極管陣列檢測器(DAD)，所有儀器均由Agilent 5.3版本的化學工作站控制。

山葡萄果皮中非花色苷酚的提取:山葡萄剝皮，液氮研磨成粉末，冷凍干燥。稱取5.000 g粉末加入50 mL 90%的丙酮水溶液，在室溫條件下，水浴搖床浸提 30 min，離心(4000 r·min－1，5 min)，重復提取5次，合并提取液，30℃旋轉蒸發至干，殘留物用甲醇定容到5 mL，－20℃保存待測。

山葡萄酒的釀造及酒中非花色苷酚類物質的萃取:葡萄漿果→精選→破碎→主發酵→皮渣分離(第4 d)→加相應葡萄品種濃縮汁→后發酵→倒罐→原酒→澄清過濾→陳釀→ －40℃冷凍保存(第30 d)，待測。此時，7個山葡萄酒的酒精度為10.7% ～11.8%，總酸度為8～10.5，符合國家山葡萄酒質量標準。葡萄酒樣的萃取條件根據Garcia－Viguera et al.［22］并有所改動。用 100 mL容量瓶分別取 100 mL的葡萄酒樣和100 mL水，混合后，用80 mL的乙酸乙酯連續萃取3次，均用分液漏斗提取分離，酯相部分30℃進行真空旋轉蒸發，殘留物溶解定容到5 mL的甲醇色譜純中，并置－30℃避光保存備用，在HPLC分析前用0.45 μm膜過濾。

高效液相色譜—質譜(HPLC－DAD－MS)分析:試驗采用Agilent 1100系列LC/MSD離子阱液相色譜—質譜聯用儀進行標準物質以及實際酒樣的LCUV－MS分析，包括在線G1379A真空溶劑脫氣機、G1311A四元高壓梯度泵、G1313A自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1315A二極管陣列檢測器(DAD)。色譜柱采用反相 250×4.6 mm，5 μm 的Zorbax SB C－18柱(Agilent Technologies)。流動相A:1.0%的醋酸水溶液;流動相B:1.0%醋酸甲醇溶液。洗脫程序:0～15 min，10% ～26%B;15～30 min，26% ～40%B;30～50 min，40% ～65%B;50～60 min，65% ～95%B;60 ～63 min，95% ～10%B;63 ～66 min，10%B。流速 1.0 mL·min－1;柱溫 25℃;檢測波長280 nm;進樣量10 μL。MSD參數:離子源為ESI，采用負離子模式;霧化氣壓力為30 psi;干燥氣流速為10 mL·min－1;干燥氣溫度為325℃;離子掃描范圍為100～1500 m·z－1。CID的MS/MS誘導碰撞能量為1.0 V。

非花色苷酚類物質標準曲線的繪制:配制8個質量濃度水平的5種混標，每個水平重復3次，以各組分的平均峰面積(y)對質量濃度(ρ，mg·L－1)在工作站中建立標準曲線［23－25］，非花色苷酚標準品、線性方程及相關系數見表1。結果表明，5種標準酚類化合物在相應的線性范圍內相關系數均在0.998以上，說明線性良好，可以滿足定量的需要。

表1 5種非花色苷酚的線性方程及相關系數

2 結果與分析

2.1 不同品種山葡萄果皮中非花色苷酚成分及其質量分數

應用HPLC－MS/MS技術，從7個品種山葡萄果皮中共檢測出非花色苷酚18種(表2和圖1)，其中苯甲酸類3種，肉桂酸類4種，黃烷－3－醇類3種，黃酮醇類5種，白藜蘆醇類3種。

由表2和圖1可以看出，不同品種山葡萄果皮檢測出的非花色苷酚成分種類和質量分數略有差別。左山一檢測出非花色苷酚12種，其中苯甲酸類2種，肉桂酸類3種，黃烷－3－醇類1種，黃酮醇類5種，白藜蘆醇類1種。所有非花色苷酚成分中，槲皮素3－O－葡萄糖苷質量分數最高，為365.302 μg·g－1。

左山二檢測出非花色苷酚12種，其中苯甲酸類3種，肉桂酸類3種，黃烷－3－醇類2種，黃酮醇類4種，白藜蘆醇類未檢測到。所有非花色苷酚成分中，反式—楊梅酮3－O－葡萄糖苷質量分數最高，為138.762 μg·g－1。

左紅一檢測出非花色苷酚15種，其中苯甲酸類2種，肉桂酸類4種，黃烷－3－醇類1種，黃酮醇類5種，白藜蘆醇類3種。槲皮素3－O－葡萄糖苷酸質量分數最高，為 446.467 μg·g－1。

左優紅檢測出非花色苷酚15種，其中苯甲酸類3種，肉桂酸類4種，黃烷－3－醇類1種，黃酮醇類5種，白藜蘆醇類2種。其中反式—楊梅酮3－O－葡萄糖苷為質量分數最高物質，為 136.653 μg·g－1。

雙紅檢測出非花色苷酚13種，其中苯甲酸類1種，肉桂酸類3種，黃烷－3－醇類3種，黃酮醇類4種，白藜蘆醇類2種。其中反式—單咖啡酰酒石酸質量分數最高，為 1020.612 μg·g－1。

圖1 不同品種山葡萄果皮中非花色苷酚HPLC色譜圖

雙優檢測出非花色苷酚10種，其中苯甲酸類2種，肉桂酸類3種，黃烷－3－醇類1種，黃酮醇類4種，白藜蘆醇類未檢測到。其中槲皮素3－O－葡萄糖苷酸為質量分數最高物質，為 427.122 μg·g－1。

雙豐檢測出非花色苷酚10種，其中苯甲酸類2種，肉桂酸類3種，黃烷－3－醇類1種，黃酮醇類4種，白藜蘆醇類未檢測到。其中槲皮素3－O－葡萄糖苷為質量分數最高物質，為 452.82 μg·g－1。

7個品種比較顯示，雙紅非花色苷酚質量分數最高，為 3172.907 μg·g－1，之后依次為左紅一、雙優、雙豐、左山一、左山二、左優紅。

對7個品種山葡萄果皮中的苯甲酸類、肉桂酸類、黃烷－3－醇類、黃酮醇類、白藜蘆醇類5類化合物的質量分數進行了分析。結果表明，肉桂酸類和黃酮醇類是山葡萄果皮非花色苷酚的主要化合物，這2類化合物的質量分數顯著高于其他3類化合物質量分數。其中左山一黃酮醇類質量分數占總非花色苷酚的61.31%，肉桂酸類占23.74%，苯甲酸類、黃烷－3－醇類、白藜蘆醇類3類僅占14.95%。左山二黃酮醇類質量分數占總非花色苷酚的57.51%，苯甲酸類和肉桂酸類分別占16.29%和11.55%，黃烷－3－醇類占14.65%，在7個品種中所含的比例最高。左紅一黃酮醇類占總非花色苷酚的55.42%，其次為肉桂酸類23.39%，白藜蘆醇類占11.91%。左優紅黃酮醇類占47.25%，其次為肉桂酸類，占24.86%，白藜蘆醇類占15.45%，在7個品種中所含的比例最高。雙紅黃酮醇類占58.56%，其次為肉桂酸類，占36.12%，苯甲酸類、黃烷－3－醇類、白藜蘆醇類3類僅占5.32%。雙優黃酮醇類占74.78%，其次為肉桂酸類，占16.04%。雙豐黃酮醇類占72.41%，其次為肉桂酸類，占20.75%。

表2 不同品種山葡萄果皮中非花色苷酚的HPLC－MS/MS鑒定成分及質量分數

2.2 不同品種山葡萄酒中非花色苷酚成分及其質量濃度

應用HPLC－MS/MS技術，從7個品種山葡萄酒中共檢測出非花色苷酚30種(表3和圖2)，其中苯甲酸類5種，肉桂酸類7種，黃烷－3－醇類5種，黃酮醇類9種，白藜蘆醇類4種。

表3 不同品種山葡萄酒中非花色苷酚的HPLC－MS/MS鑒定成分及質量濃度

表3 (續)

由表3和圖2可以看出，不同品種山葡萄酒非花色苷酚成分種類和質量濃度差別較大。左山一酒中檢測出非花色苷酚21種，其中苯甲酸類5種，肉桂酸類5種，黃酮醇類8種，白藜蘆醇類2種，黃烷－3－醇類1種。所有非花色苷酚成分中，反式—香豆酰酒石酸質量濃度最高，為 8.063 mg·L－1。

左山二檢測出非花色苷酚19種，其中苯甲酸類5種，肉桂酸類5種，黃烷－3－醇類1種，黃酮醇類7種，白藜蘆醇類1種。所有非花色苷酚成分中，反式—單咖啡酰酒石酸質量濃度最高，為43.427 mg·L－1。

左紅一檢測出非花色苷酚20種，其中苯甲酸類5種，肉桂酸類4種，黃烷－3－醇類2種，黃酮醇類7種，白藜蘆醇類2種。反式—單咖啡酰酒石酸質量濃度最高，為 66.872 mg·L－1。

左優紅檢測出非花色苷酚25種，其中苯甲酸類5種，肉桂酸類7種，黃烷－3－醇類5種，黃酮醇類6種，白藜蘆醇類2種。其中原花色素B1質量濃度最高，為 63.861 mg·L－1。

雙紅檢測出非花色苷酚21種，其中苯甲酸類5種，肉桂酸類5種，黃烷－3－醇類2種，黃酮醇類8種，白藜蘆醇類1種。其中反式—單咖啡酰酒石酸質量濃度最高，為 94.324 mg·L－1。

雙優檢測出非花色苷酚17種，其中苯甲酸類5種，肉桂酸類5種，黃烷－3－醇類未檢測到，黃酮醇類6種，白藜蘆醇類1種。其中丁香酸為質量濃度最高物質，為 8.897 mg·L－1。

雙豐檢測出非花色苷酚20種，其中苯甲酸類5種，肉桂酸類6種，黃烷－3－醇類2種，黃酮醇類5種，白藜蘆醇類2種。反式—單咖啡酰酒石酸質量濃度最高，為 32.652 mg·L－1。

7個品種比較顯示，左優紅酒中非花色苷酚質量濃度最高，為 240.965 mg·L－1，之后依次為雙紅、左紅一、左山二、雙豐、左山一、雙優。

對7個品種山葡萄酒中的苯甲酸類、肉桂酸類、黃烷－3－醇類、黃酮醇類、白藜蘆醇類5類化合物的質量濃度進行了分析。結果顯示，苯甲酸類、肉桂酸類和黃酮醇類是左山一酒中主要的非花色苷酚物質，分別占總質量濃度的37.75%、30.26%和23.85%，白藜蘆醇類僅占1.01%。左山二肉桂酸類質量濃度最高占62.87%，其次是黃酮醇類和苯甲酸類分別占17.02%、12.94%。左紅一肉桂酸類質量濃度最高，占48.26%，其次是黃烷－3－醇類占 27.53%。白藜蘆醇類占2.06%。左優紅中質量濃度最高的是黃烷－3－醇類，占48.20%，其次是肉桂酸類占39.12%。雙紅中肉桂酸類質量濃度最高，占48.08%，黃烷－3－醇類和黃酮醇類質量濃度基本相同，分別占21.05%和22.40%。雙優酒中沒有檢測到黃烷－3－醇類化合物。其酒中苯甲酸類質量濃度最高，占41.60%，肉桂酸類和黃酮醇類質量濃度基本相同，分別占28.90%和26.09%，白藜蘆醇類占3.41%，是7個品種中所占比例最高的。雙豐酒中肉桂酸類質量濃度最高，占69.50%，其次是苯甲酸類，占 17.99%。

圖2 不同品種山葡萄酒中非花色苷酚HPLC色譜圖

3 結論與討論

近年來，我國葡萄酒企業為了保持國內市場優勢和不斷開拓國外市場，都不同程度地注重了葡萄酒的質量穩定和提高。酚類物質是葡萄漿果中重要的次生代謝產物，在葡萄酒釀造過程中通過浸漬溶到酒中，對葡萄酒的色澤、風味和口感上的收斂性有重要影響，構成葡萄酒的“骨架成分”，被作為評判干型葡萄酒質量的關鍵組分，多年來，這一直為國內外葡萄與葡萄酒研究領域中的熱點。但是目前山葡萄酒市場混雜，標簽混亂，單品種酒少，勾兌酒居多，真假難辨已成為制約我國山葡萄酒產)業發展的因素。穩定和提高山葡萄酒質量，并與國際先進葡萄酒技術盡快接軌，從而有力地推動了我國特色山葡萄酒產業的發展壯大。現代發展起來的高效液相色譜—質譜(HPLC－MS/MS)技術，已成為酚類物質分析最有效的工具之一，本試驗利用HPLC－MS/MS聯用技術，分析不同品種山葡萄果皮和酒中非花色苷酚成分的差異，結果表明，不同品種山葡萄果皮非花色苷酚質量分數和酒中非花色苷酚質量濃度及組成比例不同，其組成具有品種特征，肉桂酸類和黃酮醇類是山葡萄果皮及酒非花色苷酚的主要化合物，左優紅酒與之不同，以黃烷－3－醇類和肉桂酸類為主。研究山葡萄果皮及酒中的酚類物質種類及組成比例特征，將為山葡萄品種、山葡萄酒原料品種以及山葡萄酒營養保健等方面的鑒定提供科學的依據。

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