普羅布考不同預處理療程對肝硬化大鼠肝臟缺血再灌注損傷保護作用的研究＊

王金濤，鄭 軍△，鄭衛紅，劉 偉，羅春華，王雅琴

（1.三峽大學第一臨床醫學院普外科，湖北宜昌443003；2.三峽大學醫學院藥理研究室，湖北宜昌443002；3.三峽大學第一臨床醫學院檢驗科，湖北宜昌443003；4.三峽大學醫學院病理研究室，湖北宜昌443002）

普羅布考（Probucl）具有較強的抗氧化劑作用，除了具有減少氧自由基、丙二醛（MDA）、氧化性低密度脂蛋白（ox－LDL）及腫瘤壞死因子－α（TNF－α）的合成與釋放，以及降低超氧化物歧化酶（SOD）的過度消耗之外，新近研究還表明，其對心、腎、腦等臟器的缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷有保護作用［1－2］。本研究選擇普羅布考預處理肝硬化大鼠，觀察其不同預處理療程對硬化肝臟I/R損傷的保護作用及探討其可能機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性Wistar大鼠50只，6～8周齡，體質量（220±20）g，購于湖北省實驗動物研究中心。

1.2藥品和試劑 普羅布考片（齊魯制藥廠），分析純CCl4，橄欖油。血清學檢測，于三峽大學第一臨床醫學院臨床檢驗中心檢測。SOD、MDA、髓過氧化物酶（MPO）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3模型建立及分組

1.3.1肝硬化模型的建立 Wistar大鼠自購回后適應性喂養1周，給予單因素法CCl4－橄欖油溶液腹腔注射法肝硬化造模。具體方法為：首次腹腔注射40%CCl4－橄欖油溶液2.5 mL/kg，后每3天腹腔注射CCl4－橄欖油溶液2.0mL/kg，共用藥8周死亡率為20%，剩余40只，隨機選擇10只病理切片證實肝硬化成模率100%。

1.3.2實驗分組 取剩余30只肝硬化大鼠隨機分為5組（n＝6）。（1）假手術組（A組），不進行任何藥物處理，開腹后不阻斷肝門；（2）對照組（B組），同劑量生理鹽水（1mL/100g體質量）灌胃處理，再進行肝門阻斷；（3）短期預處理組（C組），術前10日每天普羅布考－生理鹽水溶液灌胃給藥，再進行肝門阻斷；（4）中期預處理組（D組），術前20d每天普羅布考－生理鹽水溶液灌胃給藥，再進行肝門阻斷。（5）長期預處理組（E組），術前30d，每天普羅布考－生理鹽水溶液灌胃給藥，再進行肝門阻斷。

1.3.3普羅布考預處理 參照文獻［3］普羅布考大鼠灌胃劑量為500mg·kg－1·d－1，使用前用生理鹽水配成25mg/mL溶液，給予大鼠1mL/100g灌胃處理，2次/日。

1.3.4大鼠肝臟I/R模型的建立 術前禁食8h，自由飲水，3%戊巴比妥那（30～50mg/kg）腹腔注射麻醉，常規消毒鋪巾，上腹正中切口進腹，參照Pringle法建立大鼠70%肝臟I/R模型［4］，以無菌橡皮筋纏繞肝門做肝門阻斷，阻斷肝門30min后，恢復入肝血流2、4h。

1.4標本處理及檢測指標 分別于術前1d及再灌注2h時，在大鼠頸靜脈體外穿刺采血1.5mL，再灌注4h時將各組大鼠迅速處死，下腔靜脈采血2mL后，隨即切取肝臟標本，部分用于檢測SOD、MDA、MPO；部分用于普通光學顯微鏡下觀察；部分用于電鏡下觀察。所采血液標本均常溫下放置60 min，以3 000r/min離心10min，取上層血清，進行血清學檢測。

1.5統計學處理 采用SPSS11.0軟件進行統計分析。數據以s表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較，方差齊時用LSD法和SNK法進行，方差不齊時用Tamhane′s T2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1各組大鼠手術前后各時間點血清ALT、AST、LDH及AKP的水平 術前1d各組大鼠血清ALT、AST、LDH及AKP的水平差異無統計學意義。再灌注2h，B、C、D組ALT、AST及LDH水平均明顯高于 A組（P＜0.01），A、C、D、E組ALT及LDH水平均明顯低于B組（P＜0.05）；AKP水平B組高于 A、E組（P＜0.05）。再灌注4h，B、C、D組 ALT、AST及LDH水平均明顯高于 A組（P＜0.05），A、D、E組 ALT、AST、LDH 及 AKP水平均明顯低于 B組（P＜0.01），見表1～4。

2.2各組大鼠再灌注4h后肝組織中SOD、MDA及MPO的活性測定 B、C、D組SOD活性均明顯低于A組（P＜0.01），A、E組SOD活性均明顯高于 B組（P＜0.01）；B、C、D、E組MDA活性均明顯高于 A組（P＜0.01），A、D、E組 MDA及MPO活性均明顯低于B組（P＜0.01）；B、C組 MPO活性均明顯高于A組（P＜0.01），見表5。

2.3病理組織學改變 HE染色后切片光鏡下觀察，各組大鼠肝組織均呈典型肝硬化表現。A組：假小葉形成，炎性反應輕微，膽管增生，未見明顯肝細胞壞死區；B組：假小葉形成，炎性反應非常明顯，并且出現炎性反應帶，肝細胞大量壞死，肝索排列紊亂；C組：假小葉形成，脂肪變性，炎性反應稍輕，肝竇充血擴張和點狀肝細胞腫脹變性及壞死；D組：假小葉形成，肝細胞核固縮，炎性反應輕微；E組：較B、C、D組的損害程度為輕（封2圖1、封3圖2）。

表1 各組大鼠手術前后各時間點血清ALT水平（s，U/L，n＝6）

表1 各組大鼠手術前后各時間點血清ALT水平（s，U/L，n＝6）

＃：P＜0.01，與A組比較；△：P＜0.05，▲：P＜0.01，與B組比較。

1d 2h 4h A組 136.17±43.59 135.50±43.39▲ 156.50±49.40組別 術前▲B組 134.83±37.69 733.17±168.62＃ 1035.17±185.14＃C組 135.00±33.88 410.00±32.79＃△ 710.67±83.91＃D組 128.50±36.48 280.50±31.71＃△ 393.50±81.96＃▲E組 137.33±41.21 228.17±73.54▲ 305.33±34.67▲

表2 各組大鼠手術前后各時間點血清AST水平（s，U/L，n＝6）

表2 各組大鼠手術前后各時間點血清AST水平（s，U/L，n＝6）

＃：P＜0.01，與A組比較；△：P＜0.05，▲：P＜0.01，與B組比較。

2h 4h A組 271.17±58.97 274.83±61.98▲ 277.83±61.13組別 術前1日▲B組 271.50±38.56 1 066.67±239.93＃ 1 253.83±258.27＃C組 260.83±58.96 680.67±151.05＃ 808.50±159.59＃D組 297.50±21.53 439.00±50.56＃△ 563.50±84.84＃▲E組 261.00±46.81 392.17±73.05▲ 480.50±107.89▲

表3 各組大鼠手術前后各時間點血清LDH水平（s，U/L，n＝6）

表3 各組大鼠手術前后各時間點血清LDH水平（s，U/L，n＝6）

＃：P＜0.01，與A組比較；▲：P＜0.01，與B組比較。

2h 4h A組 644.00±77.84 650.50±91.97▲ 654.50±90.54組別 術前1日▲B組 656.50±54.67 2 836.50±549.69＃ 3 528.00±548.38＃C組 667.33±58.07 2 012.33±252.30＃▲2 516.50±388.80＃D組 666.33±68.31 1 340.00±178.71＃▲1 737.67±170.94＃▲E組 660.83±64.34 1 012.00±371.98▲ 1 259.33±434.52▲

表4 各組大鼠手術前后各時間點血清AKP水平（s，U/L，n＝6）

表4 各組大鼠手術前后各時間點血清AKP水平（s，U/L，n＝6）

＃：P＜0.01，與A組比較；△：P＜0.05，▲：P＜0.01，與B組比較。

2h 4h A組 144.50±29.30 144.00±40.43△ 148.67±39.08組別 術前1日▲B組 156.67±24.95 188.83±38.97 239.33±37.42＃C組 165.00±29.03 179.50±26.36 227.83±35.61＃D組 150.83±14.20 158.00±16.49 172.00±18.78▲E組 141.00±26.25 145.50±30.80△ 158.33±31.43▲

2.4各組大鼠肝臟細胞電鏡下超微結構改變 A組線粒體輕微腫脹，嵴清晰，粗面內質網結構尚可，未見擴張；與A組相比，B組線粒體結構模糊，嵴斷裂消失，粗面內質網數量大量減少，脫顆粒明顯，胞質內水腫嚴重；C、D組線粒體與內質網較B組形態為好，粗面內質網有脫顆粒現象；E組形態趨于A組形態，線粒體腫脹明顯減輕，嵴較少斷裂，內質網輕度擴張，見圖3。

表5 各組大鼠再灌注4h后肝組織中SOD，MDA及MPO的含量測定（s，n＝6）

表5 各組大鼠再灌注4h后肝組織中SOD，MDA及MPO的含量測定（s，n＝6）

＊：P＜0.01，與A組比較；＃：P＜0.01，與B組比較。

組別 SOD（nmol/mgProt）MDA（nmol/mgProt）MPO（U/g）A組 230.33±42.61＃ 1.32±0.18＃ 1.04±0.16＃B組 139.67±30.85＊ 2.38±0.26＊ 1.55±0.20＊C組 156.50±37.99＊ 2.22±0.15＊ 1.38±0.19＊D組 172.00±18.78＊ 1.82±0.13＊＃ 1.20±0.12＃E組 204.00±39.35＃ 1.75±0.16＊＃ 1.17±0.12＃

圖3 透射電子顯微鏡下各組肝細胞超微結構（×20k）

3 討 論

如何防治硬化肝臟I/R損傷是處理各種肝臟切除、肝移植術后一系列后續問題的關鍵所在。目前肝臟I/R損傷機制還不明確，缺乏特異性防治措施，目前最為有效的手段就是藥物預處理。

通過對I/R損傷發病機制的不斷研究發現，I/R損傷過程中的肝臟處于相對缺氧的微環境，從而導致內源性抗氧化劑的缺失和氧化應激反應［5－6］。抗氧化劑已經被明確證實，可以通過改善內源性親氧化劑與抗氧化劑之間的平衡，削弱氧化應激反應梯度，降低Kupffer細胞線粒體內源性活性氧的生產，減少肝細胞的炎性反應及凋亡［7－8］。實驗證明，抗氧化劑在防治I/R損傷的作用越來越受到重視，而普羅布考是目前可用于臨床的抗氧化作用最強的人工合成抗氧化劑，其在大鼠離體心臟I/R過程中，可以通過增加內源性抗氧化劑儲備來降低I/R損傷；能明顯改善肝損傷患者的肝功能儲備；還可以抑制在I/R損傷過程中過渡表達的TNF－α誘導的內皮細胞凋亡［9－12］。

為了探討普羅布考不同預處理療程對硬化肝臟I/R損傷是否具有保護作用及能否常規用于肝門阻斷術前，作者設計并完成了本實驗。

當肝細胞發生損傷或壞死時，血清ALT、LDH、AKP及AST水平是目前臨床上反映急、慢性肝損傷程度的敏感指標。SOD可以明顯減少氧化應激反應中產生的氧自由基，從而減輕對正常細胞的攻擊；MDA影響線粒體呼吸鏈復合物及線粒體內關鍵酶活性，具有細胞毒性；每個中性粒細胞中MPO的含量相對恒定，因此組織中MPO的含量基本可定量組織中中性粒細胞的數量［13］，從而間接判斷炎性反應以及肝臟受損的程度。圖1及圖2顯示了普羅布考不同療程預處理（C、D、E組）的大鼠肝臟細胞浸潤、肝竇充血擴張和肝細胞腫脹變性壞死程度明顯輕于B組。這表明普羅布考預處理可以顯著減輕I/R損傷，對肝臟I/R具有明確的保護作用。

普羅布考在對大鼠硬化肝臟I/R損傷之前，就預先啟動內源性保護機制［14］，從而阻止I/R與肝損害之間的惡性循環，明顯保護肝細胞損傷時線粒體的超微結構。

通過以上實驗數據及觀察表明：本研究證明抗氧化劑普羅布考在中長療程（20、30d）預處理大鼠硬化肝臟I/R損傷時具有保護作用，其機制可能是：（1）通過增加內源性抗氧化劑的儲備，降低SOD的過度消耗；（2）顯著降低大鼠硬化肝臟I/R過程組織中MPO含量，從而抑制中性粒細胞浸潤，降低對肝組織的損傷；（3）通過減少氧自由基及其攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸形成的MDA，進一步減輕I/R對肝臟組織造成的損傷。存在局限性是：人鼠存在差異，普羅布考是否在臨床上對硬化肝臟I/R損傷具有保護作用，這些都有待大量的實驗研究，為最終的臨床應用提供理論基礎。

［1］Ruixing Y，Al－Ghazali R，Wenwu L，et al.Pretreatment with probucol attenuates cardiomyocyte apoptosis in a rabbit model of ischemia/reperfusion［J］.Scand J Clin Lab Invest，2006，66（7）：549－558.

［2］Hoshida S，Yamashita N，Igarashi J，et al.Long－term probucol treatment reverses the severity of myocardial injury in watanabe heritable hyperlipidemic rabbits［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，1997，17（11）：2801－2807.

［3］杜九中，李雙杰，周京敏.普羅布考對小鼠柯薩奇B3病毒性心肌炎的治療作用［J］.中華實用診斷與治療雜志，2009，23（9）：232－233.

［4］Yang YL，Li JP，Xu XP，et al.Protective effects of tumor necrosis factor antibody and ulinastatin on liver ischemic reperfusion in rats［J］.World J Gastroenterol，2004，10（21）：3161－3164.

［5］Bhogal RH，Curbishley SM，Weston CJ，et al.Reactive oxygen species mediate human hepatocyte injury during hypoxia/reoxygenation［J］.Liver Transpl，2010，16（11）：1303－1313.

［6］高元興，秦華東，劉冬冬，等.抗氧化劑在降低肝缺血再灌注損傷中的作用［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2009，13（5）：911－914.

［7］Videla LA.Cytoprotective and suicidal signaling in oxidative stress［J］.Biol Res，2010，43（3）：363－369.

［8］Allan PF，Bloom BB，Wanek S.Reversal of hemorrhagic shock－associated hepatic ischemia－reperfusion injury with N－acetylcysteine［J］.Mil Med，2011，176（3）：332－335.

［9］Muriel P.Role of free radicals in liver diseases［J］.Hepatol Int，2009，3（4）：526－536.

［10］楊世杰.藥理學［M］.北京：人民衛生出版社，2005：343.

［11］Merat S，Aduli M，Kazemi R，et al.Liver histology changes in nonalcoholic steatohepatitis after one year of treatment with probucol［J］.Dig Dis Sci，2008，53（8）：2246－2250.

［12］段緯喆.辛伐他汀和普羅布考對TNF－α誘導的內皮細胞凋亡的影響［D］.湖南：中南大學，2010.

［13］Locatelli F，Gauly A，Czekalski S，et al.The MPO Study：just a Eur opean HEMO Study or something very different？［J］.Blood Purif，2008，26（1）：100－104.

［14］Kumar D，Kirshenbaum LA，Li T，et al.Apoptosis in adriamycin cardiomyopathy and its modulation by probucol［J］.Antioxid Redox Signal，2001，3（1）：135－145.