冬蟲夏草經腫瘤滋養動脈插管注入對兔VX2肝癌模型的療效研究＊

羅小平，劉 曦，曹聞挺，鄧 昊

（重慶醫科大學附屬第二醫院放射介入中心 400010）

經導管動脈化療栓塞術（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）作為肝癌非外科手段被國內外廣泛采用，目前為非外科治療的首選方法［1－2］，因藥物療效、肝癌的生物學特性等原因，TACE療效總難盡人意，改進其技術方法、獲取最有效藥物是TACE研究的重點。冬蟲夏草被廣泛應用于免疫、心血管、呼吸、泌尿生殖、消化、神經系統疾病的治療而備受關注；文獻報道，其對人乳腺癌、Balb－c裸鼠非小細胞肺癌、小鼠H22肝癌等具有明顯抑制作用［3－5］，可使腫瘤細胞凋亡，同時具有明顯促進急性肝功能損害的恢復［6］，本實驗擬通過兔VX2肝癌模型的腫瘤滋養動脈內灌注冬蟲夏草提取物以研究其治療價值。

1 方 法

1.1研究對象 新西蘭大白兔40只（重慶醫科大學動物實驗中心），許可證號：SCXK（渝）2007－0001。體質量2.5～3.0kg，雌雄不限。VX2腫瘤細胞珠（重慶醫科大學生物工程系），速眠新（沈陽軍事醫學科學院）。本研究嚴格遵守動物實驗的各項倫理條例。按照文獻［7］的方法建立兔VX2肝癌模型。

1.2設備與器材 設備器材包括美國GE公司LightSpeed 16層螺旋 CT；日本島津1250MA DIGTEX PREMIER VC X線機；日本泰爾茂公司4Fcobra導管、4F導管鞘、2.7FPE導管及20G動脈穿刺針。天然冬蟲夏草（重慶醫藥公司中藥材商店購）；超液態碘油（法國Guerbet）。

1.3實驗動物分組 40只經CT掃描證腫瘤移植成功的VX2兔，按成組設計法隨機平分為4組，以肝動脈內注入物不同分為A組（超液態碘油），B組（冬蟲夏草提取液），C組（冬蟲夏草提取液＋超液態碘油），D組（生理鹽水）。

1.4介入方法及術后處理

1.4.1蟲草提取液的制備 10g天然蟲草粉碎后以90～95℃蒸餾水50mL提取3h，過濾、減壓濃縮至約1/3量，再以90～95℃殺菌30min，－38℃冷凍干燥得提取物，高效液相色譜法測定濃縮液中腺苷濃度，濃度為1 375.7μg/L，超過《中國藥典》中對于蟲草的質量控制標準。用生理鹽水配制成相應濃度，NaOH 調節pH 值為7.2～7.4［8］。

1.4.2實驗方法 以速眠新0.5mg/kg肌內注射行麻醉，劍突下縱行切開腹壁約2.5cm并暴露肝臟，分別以約2mm×2 mm×2mm VX2瘤組織1粒（取自荷瘤兔）埋入肝中葉約3 mm深處移植2個病灶，間隔約2cm，2周后行CT平掃及增強，參數為120kV，200mA，FOV 7.5cm×7.5cm，層厚5 mm；碘海醇以0.8mL/s、總量8mL注入。

以5%硫化鈉液體于右腹股溝脫毛，速眠新0.5mg/kg肌內注射麻醉，仰臥固定于自制木板；右側腹股溝區消毒、鋪巾，于股動脈搏動最強處縱行切開皮膚約3mm，以血管鉗鈍性游離股血管鞘，直視下以20G穿刺針與體表成角約15～20°沿髂動脈走行方向穿刺股動脈，將0.021英寸超滑微導絲經穿刺針插入股動脈并達上腹區，沿導絲插入4F導管鞘，經鞘以4F Cobra導管插至腹主動脈上部前壁并插入腹腔干動脈后行DSA檢查；依據DSA顯示作引導，以2.7FPE微導管行同軸插管越過胃動脈等至腫瘤滋養動脈后再行DSA檢查證實［4］；經微導管分別注入超液態碘油（0.5mL）、冬蟲夏草提取液（0.5mL）、冬蟲夏草提取液（0.5mL）＋超液態碘油（0.5mL）混懸液、生理鹽水（0.5mL），并用0.5mL生理鹽水沖洗微導管以保證藥物全部進入腫瘤血管；以明膠海綿條塊填塞穿刺點周圍后拔管并壓迫止血約15min，縫合、包扎切口；以慶大霉素4萬U及青霉素80萬U肌內注射（1次/天，連續3d），單籠飼養、加強清潔等護理。僅將術后生存滿7d并獲得病理標本者成組。

1.5腫瘤增長率檢測 實施介入后7d按上述方法再分別行CT掃描，計算腫瘤體積V2，并計算腫瘤增長率＝（V2－V1）/V1%。測量腫瘤最大直徑d1及與之成垂直方向的最小直徑d2，利用公式V1＝d1×d22/2計算腫瘤體積V1。

1.6病理學檢測 實驗后7d行CT檢查并處死實驗兔，取腫瘤及周圍0.5cm×0.5cm×0.5cm肝組織，以10%甲醛固定、石蠟包埋、5μm連續切片，行HE染色，以200倍光學顯微鏡觀察，重點為細胞壞死、細胞核碎裂。

1.7統計學處理 應用SPSS17.0軟件進行統計學分析，各實驗組間的比較用單因素方差分析，多組的兩兩間比較用LSD法檢驗，兩組間比較用成組t檢驗，對方差不齊者用秩和檢驗，血管內皮生長因子（VEGF）表達與微血管密度（MVD）值比較采用雙變量相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1實驗兔結果 本研究共實施兔肝VX2腫瘤移植51只，術中無死亡，移植后14d內因感染等因素死亡11只，進行實驗研究者40只。

2.2CT及DSA檢查結果 介入治療前CT表現：平掃見腫瘤病灶呈類圓形低密度結節影，邊界欠清晰，密度較均勻，中心見更低密度區；增強示病灶動脈期邊緣環狀強化、中心區無強化35只（圖1A），病灶全部強化5只；門脈期、延遲期病灶無強化、邊緣清晰。肝動脈DSA表現：腫瘤周邊血管增粗、扭曲、紊亂，病變中心血管相對較少；1支及1支以上腫瘤滋養動脈分別為14、26只，A、B、C、D組均成功進行超選擇性插管（圖1B、C）。術后7dCT表現：A組18個病灶，C組20個病灶區周邊大量碘油沉積、中心碘油沉積較少（圖1D）；術后各組病灶體積、肝內及腹腔內轉移、腹水等表現見表1。

表1 術后7d病灶大體病理結果（n）

2.3腫瘤增長率比較結果 實驗前A、B、C、D組腫瘤體積分別為（387.5±157.3）、（401.1±164.9）、（375.1±154.3）、（375.1±184.0）mm3，各組比較差異無統計學意義（F＝0.255，P＝0.855）；實驗后各組腫瘤體積分別為（922.6±32.9）、（685.8±97.9）、（352.5±171.8）、（1 403.5±409.2）mm3，各組比較差異有統計學意義（F＝26.13，P＝0.030）。4組腫瘤增長倍數分別為1.9、0.85、－0.05、2.6倍。

表2 術后各個腫瘤壞死結果（n）

圖1 實驗兔病灶CT及DSA表現

2.4病理結果 所有獲取的病理組織采用HE染色、200倍光鏡觀察：介入治療前可見癌細胞大小、形態不一，排列紊亂，細胞核大，深染，核漿比例增大，呈浸潤型生長，腫瘤中心可見黃白色凝固性壞死。介入治療組術后腫瘤大部分呈凝固性壞死，邊緣成熟血管萎縮、閉塞、消失，殘留少許不成熟的血管內皮細胞。A組見部分細胞核碎裂，細胞結構基本完整，細胞間界限清晰（封2圖2A）。B組多數腫瘤細胞核碎裂、體積縮小，細胞間界限模糊、間隙加大提示腫瘤細胞部分壞死（封2圖2B）。C組細胞體積明顯縮小、細胞核碎裂、分界模糊，細胞大體結構不能分辨，細胞間間隙明顯增加提示細胞基本壞死（封2圖2C）。D組腫瘤細胞整體完整，細胞核結構、邊界清晰，未見壞死征象（封2圖2D）。術后病灶顯微病理改變見表2。

3 討 論

VX2腫瘤為Shope病毒注入兔皮內誘發的鱗癌，通過反復傳代后成為兔可移植性腫瘤，在肝臟移植成功率高，其生長、浸潤、轉移等生物學特性相似人類原發性肝癌，因此，兔VX2肝癌模型被廣泛作為肝癌藥物、新技術研究的經典實驗模型［5］。

在經兔肝動脈插管實驗研究時，因肝動脈細小、迂曲，4F導管僅能插管至腹腔干動脈，無法插入細小的腫瘤滋養動脈注入藥物，致使實驗不準確、實驗兔死亡率高；文獻顯示眾多實驗研究采用剖腹肝動脈插管或經股動脈穿刺肝固有動脈注入藥物［6－7］，而本研究均采用2.7FPE超滑微導管超選擇性行病變滋養動脈插管注入藥物，使藥物更為準確注入病變區、且減少甚至避免非腫瘤肝組織損害（圖1B、C），這與目前臨床原發性肝癌TACE治療普遍主張采用超選擇性插管栓塞相一致［8－9］，本實驗研究發現采用該技術方法后實驗兔意外死亡率較低。

國內外學者實驗研究顯示冬蟲夏草除可提高機體免疫機能外，其對乳腺癌、肺癌、前列腺癌等均有明顯治療作用［3，10－12］，以其治療肝癌，尤其是經肝癌腫瘤滋養動脈直接注入的治療作用研究較少報道，原發性肝癌病灶均主要接受肝動脈供血且為富血供腫瘤為學術界所公認［13］，本課題以其提取液經腫瘤滋養動脈注入可明顯提高腫瘤局部藥物濃度增強療效。

本研究顯示，單純冬蟲夏草提取液即可以明顯抑制腫瘤病灶生長、生長減慢，促使腫瘤細胞壞死、腫瘤局部滋養動脈減少（圖2A），同時降低腫瘤肝內及腹腔轉移發生概率，其作用機制尚不清楚，研究結果表明冬蟲夏草可以抑制腫瘤生長、轉移，明顯提高實驗兔的存活率，不僅與其抑制腫瘤生長有關，張小強等［14］研究表明其對肝急性化學性損傷具有保護作用，也可能同時具有保護肝功能進而提高實驗兔生存率密切相關。

徐輝等［15］報道，肝癌在TACE術后血管內皮生長因子（VEGF）等血管生長因子可促使血管新生，進而促使殘存腫瘤快速生長、轉移，本實驗顯示冬蟲夏草除促使腫瘤壞死、縮小之外，術后局部腫瘤滋養動脈有減少、甚至有閉塞改變（表2），因此，其可能具有抑制腫瘤血管新生的作用，有待在進一步的實驗研究中予以證實。

實驗顯示冬蟲夏草提取液混合碘油后，對于抑制腫瘤生長、轉移，以及提高生存率方面明顯優于單純提取液組（圖2A、B），這和其與混合碘油后，冬蟲夏草抗腫瘤成分高濃度、長時間作用于腫瘤組織密切相關。臨床肝癌TACE治療中，碘油與化療藥物混合可顯著提高治療局部肝癌的療效，也間接證實了C組療效優于B組的結果（圖2）。

研究同時顯示，單純碘油注入腫瘤滋養動脈后，雖然部分病例未增大，但腫瘤血管無減少、閉塞表現，這與碘油進入腫瘤滋養動脈后，其細小油珠進入腫瘤毛細血管床，可以減少腫瘤血液供應，繼而部分抑制腫瘤生長，但其并不能使局部腫瘤明顯壞死。

綜上所述，冬蟲夏草經腫瘤滋養動脈注入對兔VX2肝癌模型的腫瘤組織生長有抑制作用，能明顯減少腫瘤肝內及遠處轉移的發生率，抑制局部腫瘤滋養血管的生長，尤其是與碘油混合后，因局部長時間高濃度的藥物作用可以明顯提高治療效果，對于該結果是否適于人類肝癌治療，有待進一步研究證實。

［1］Kim JH，Kim JH，Choi JH，et al.Value of the model for end－stage liver disease for predicting survival in hepatocellular carcinoma patients treated with transarterial chemoembolization［J］.Scand J Gastroenterol，2009，44（3）：346－357.

［2］Miyayama S，Mitsui T，Zen Y，et al.Histopathological findings after ultraselective transcatheter arterial chemoembolization for hepatocellular carcinoma［J］.Hepatol Res，2009，39（4）：374－381.

［3］劉東穎，謝廣茹，史玉榮，等.冬蟲夏草對乳腺癌細胞凋亡的誘導及相關基因表達的調控［J］.天津醫科大學學報，2007，13（2）：206－209.

［4］Yoo HS，Shin JW，Cho JH，et al.Effects of Cordyceps militaris extract on angiogenesis and tumor growth［J］.Acta Pharmacol Sin，2004，25（5）：657－665.

［5］Liang XM，Tang GY，Cheng YS，et al.Evaluation of a rabbit rectal VX2carcinoma model using computed tomography and magnetic resonance imaging［J］.World J Gastroenterol，2009，15（17）：2139－2144.

［6］魯東，呂維富，高斌，等.兔VX2肝癌肝動脈栓塞術后腫瘤新生血管的變化與分析［J］.中國介入影像與治療學，2010，7（3）：305－308.

［7］鐘靈，俞志堅，慕革非，等.兔VX2肝癌模型的肝動脈插管技術改良及 DSA表現［J］.實用醫學雜志，2007，23（12）：1803－1805.

［8］Ye SL.Expert consensus on standardization of the management of primary liver cancer［J］.Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2009，17（6）：403－410.

［9］羅小平，謝微波，何明菊，等.小肝癌腫瘤滋養動脈超選擇性無水乙醇栓塞治療的臨床價值（附95例報告）［J］.重慶醫科大學學報，2009，34（7）：951－954.

［10］孫艷，孫艷影，杜鳳霞.冬蟲夏草精粉抗腫瘤作用的實驗研究［J］.中華中醫藥學刊，2007，25（10）：2172－2173.

［11］陳曉燕.冬蟲夏草的藥理與臨床研究進展［J］.中醫藥導報，2009，15（2）：91－92.

［12］徐晉，傅雷，姚樂申.冬蟲夏草合用順鉑誘導非小細胞肺癌凋亡的研究［J］.南京中醫藥大學學報，2008，24（6）：398－400.

［13］牛煥章，滕皋軍，鄧鋼，等.兔VX2肝癌模型的影像學表現和栓塞技術的實驗研究［J］.中國醫學影像技術，2006，22（6）：797－800.

［14］張小強，浦躍樸，尹立紅，等.冬蟲夏草及人工蟲草菌絲體對CCI4所致急性化學性肝損傷的保護作用［J］.環境與職業醫學，2003，20（6）：422－426.

［15］徐輝，王濱，高志芹，等.肝動脈化療栓塞術后殘癌組織血管內皮生長因子表達的研究［J］.臨床放射學雜志，2004，23（12）：620－622.