3，6－二羥黃酮抗乳腺癌發生過程中miRNA表達譜的變化＊

常 徽，王 湛，謝 艷，糜漫天

（第三軍醫大學營養與食品安全研究中心/重慶市營養與食品安全重點實驗室，重慶400038）

微RNA（microRNA，miRNA）是小RNA的一種，可與其靶RNA的3′端非特異區結合，引起靶信使RNA（mRNA）的翻譯抑制或降解。研究發現，某些miRNA在腫瘤的發生和發展過程中扮演非常重要的角色，起到癌基因或抑癌基因的作用［1－3］。miRNA的發現與研究為乳腺癌的防治提供了新的途徑［4－6］。植物黃酮抗腫瘤作用研究一直受到關注，但其抗腫瘤機制是否涉及對miRNA表達和功能的影響，國內外尚少見報道。本研究前期藥效學篩選試驗發現3，6－二羥黃酮具有很強的抗腫瘤作用［7－9］，但其體內抗腫瘤發生效應尚缺乏研究。本研究觀察3，6－二羥黃酮對 N－甲基－N－亞硝脲（MNU）誘導大鼠乳腺癌發生的抑制作用，同時利用基因芯片技術檢測大鼠乳腺組織miRNA表達譜的變化，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 6～7周齡健康雌性SD大鼠，體質量145～165g，由第三軍醫大學實驗動物中心提供［scxk（軍）2007015］，飼養于SPF動物實驗室。雌性SD大鼠依照完全隨機設計原則均分為自然對照、模型對照和實驗組，自然對照組8只，模型對照和實驗組各14只。MNU和3，6－二羥黃酮購自Sigma公司，Trizol為Invitrogen公司產品，GeneChip?miRNA芯片及相關試劑盒均為美國Affymetrix公司產品，本芯片覆蓋了71個物種的miRNA，針對7 815個 miRNA設計了共計46 228個探針，數據來自 Sanger miRBase miRNA database V11（http：//microrna.sanger.uk）。

1.2方法

1.2.1動物處理 實驗組給予3，6－二羥黃酮灌胃（20mg·kg－1·d－1），兩對照組給予生理鹽水灌胃，實驗組和模型對照組一次注射MNU 50mg/kg，制造乳腺癌動物模型，自然對照組注射生理鹽水，分組喂養18周，觀察各組腫瘤發生率。另取雌性SD大鼠，以前述方法分組和處理，每組12只，分別于MNU注射0、4、8、18周取材，提取乳腺組織總RNA并分離miRNA，通過芯片掃描和數據分析獲得miRNA表達譜。

1.2.2乳腺組織總RNA的提取 剪取大鼠乳腺組織0.1g，制備組織勻漿，利用Trizol試劑抽提數次，常規提取總RNA。每個樣品取1μL，ddH2O稀釋200倍后用核酸蛋白定量儀測定RNA含量與純度。整個過程所有使用的器械及液體均經0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）水處理，戴消毒手套操作，防止RNA酶污染。

1.2.3miRNA表達譜的檢測 取50～100μg總RNA，利用miRNA Isolation Kit分離小 RNA，采用PolyA Polymerase加尾，利用T4RNA連接酶將帶有生物素標記的信號分子與之連接，進行標記，然后將生物素標記的小分子RNA溶于16μL雜交液中［15%甲酰胺，0.2%聚丙烯酰胺（SDS），3×檸檬酸鈉緩沖液（SSC），50×純化試劑（Denhardts）］。于42℃與微陣列雜交過夜。雜交結束后，微陣列玻片于42℃下用含0.2%SDS的2×SSC漂洗4min，再在0.2×SSC室溫漂洗4min。玻片甩干后，用LuxScan 10K/A雙通道激光掃描儀進行掃描，采用微陣列顯著點分析（SAM）2.1版軟件分析有統計學意義的差異表達位點。

1.3統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件進行單因素方差分析，腫瘤發生率的比較采用χ2檢驗，兩組間差異比較采用t檢驗，所有數據均以s表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.13，6－二羥黃酮膳食干預對乳腺癌發生的抑制作用 實驗結束時，3組大鼠之間體質量差異無統計學意義，表明3，6－二羥黃酮膳食處理對大鼠無明顯毒副作用。自然對照組大鼠無乳腺腫瘤發生。與模型對照組相比，實驗組乳腺腫瘤發生率降低了35.8%，顯著低于模型對照組，表明3，6－二羥黃酮膳食處理能夠顯著抑制化學致癌劑MNU誘導的大鼠乳腺腫瘤發生，見表1。

表1 3組膳食干預對MNU誘導大鼠乳腺腫瘤發生率及體質量的影響

2.2大鼠乳腺腫瘤發生過程中miRNA表達譜的變化及3，6－二羥黃酮膳食干預的影響 miRNA芯片檢測結果表明，致癌劑MNU注射后，大鼠乳腺組織miRNA表達譜發生顯著變化，其中MNU注射4周時，模型對照組檢測到11個miRNA表達顯著上調，18個miRNA表達顯著下降；8周時12個miRNA表達顯著上調，17個顯著下降；18周時17個顯著上調，18個顯著下降，見表2。與模型對照組相比，實驗組4周時檢測到10個miRNA表達顯著上調，9個miRNA表達顯著下降；8周時15個miRNA表達顯著上調，10個顯著下降；18周時11個顯著上調，12個顯著下降，見表3。這些miRNA可能在3，6－二羥黃酮抗乳腺癌發生過程中發揮作用。

表2 MNU誘導大鼠乳腺腫瘤發生過程中miRNA表達譜的變化

表3 與模型對照組相比實驗組大鼠miRNA表達譜的變化

3 討 論

植物黃酮為一類天然植物多酚化合物，具有抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤等生物學效應，特別是其抗腫瘤活性以其天然、低毒、高效而備受關注［10－11］。本研究前期藥效學篩選實驗發現，3，6－二羥黃酮具有很強的體外抗腫瘤活性，對乳腺癌細胞、結腸癌細胞、前列腺癌細胞、白血病細胞均表現出強細胞毒性和凋亡誘導作用［7－9］。3，6－二羥黃酮的抗腫瘤作用國內外尚少見報道，特別是其體內抗腫瘤效應如何尚不清楚。MNU誘導大鼠乳腺癌發生是研究乳腺癌發生的經典動物模型，本課題利用此動物模型觀察了3，6－二羥黃酮抗乳腺癌發生的效應，結果表明，3，6－二羥黃酮膳食干預可顯著抑制致癌劑誘導的大鼠乳腺腫瘤發生，顯示出較強的乳腺癌化學預防作用。

miRNA是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它可以抑制蛋白質翻譯，剪切mRNA，調節靶基因的表達，在動植物中參與轉錄后基因表達調控。越來越多的研究表明，miRNA參與包括肝癌、肺癌、乳腺癌、結腸癌及白血病在內的多種腫瘤的發生、發展［12－13］。乳腺癌是女性最常患的一種腫瘤，男性由于缺乏對乳腺癌的免疫能力，同樣容易罹患此病。有研究發現作為抑癌基因和原癌基因的乳腺癌特異性miRNA，在乳腺癌發生、發展中的作用對于防治乳腺癌具有重要意義［14－15］。

植物黃酮抗乳腺癌作用機制中是否涉及對miRNA表達和功能的影響，尚少見報道，本實驗研究發現，3，6－二羥黃酮抗乳腺癌發生過程中，伴隨著miRNA表達譜的改變，提示某些miRNA可能在3，6－二羥黃酮抗乳腺癌作用機制中扮演重要角色，黃酮化合物可能通過調節miRNA的表達進而影響某些關鍵靶蛋白的活性。本研究結果對深入探討miRNA在植物黃酮抗腫瘤機制中的作用提供了參考。

［1］劉展，張明亮，李毅妮，等.siRNA抑制p63基因表達對膽管癌細胞增殖和侵襲的影響［J］.南方醫科大學學報，2012，32（2）：207－210.

［2］姜昌麗，王惠萱.微小RNA在結直腸癌中的研究進展［J］.國際檢驗醫學雜志，2011，32（3）：355－357.

［3］Hui C，Yujie F，Lijia Y，et al.MicroRNA－34aand microRNA－21play roles in the chemopreventive effects of 3，6－dihydroxyflavone on 1－methyl－1－nitrosourea－induced breast carcinogenesis［J］.Breast Cancer Res，2012，14（3）：R80.

［4］孫曉飛.miRNA與乳腺癌［J］.醫學信息：下旬版，2009，22（9）：269－270.

［5］李川，馬紀，張越，等.慢病毒介導的shRNA靶向干擾nestin鼻咽癌穩定細胞株的建立［J］.南方醫科大學學報，2011，31（4）：604－609.

［6］梁艷，李濤，周克元.慢病毒載體在RNA干擾中的應用進展［J］.國際檢驗醫學雜志，2010，31（11）：1282－1284.

［7］Chang H，Lin H，Yi L，et al.3，6－Dihydroxyflavone induces apoptosis in Leukemia HL－60Cell via reactive oxygen species－mediated p38MAPK/JNK pathway［J］.Eur J Pharmacol，2010，648（1）：31－38.

［8］Chang H，Mi M，Ling W，et al.Structurally related anticancer activity of flavonoids：involvement of reactive oxygen species generation［J］.J Food Biochem，2010，34（s1）：1－14.

［9］Chang H，Mi M，Ling W，et al.Structurally related cytotoxic effects of flavonoids on human cancer cells in vitro［J］.Arch Pharm Res，2008，31（9）：1137－1144.

［10］Chang H，Yu B，Yu X，et al.Anti－cancer activities of an anthocyanin－rich extract from black rice against breast cancer cells in vitro and in vivo［J］.Nutr Cancer，2010，62（8）：1－9.

［11］Theodoratou E，Kyle J，Cetnarskyj R，et al.Dietary flavonoids and the risk of colorectal cancer［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2007，16（4）：684－693.

［12］Kim YK，Kim VN.Processing of intronie microRNAs［J］.EMBO J，2007，26（3）：775－783.

［13］Filipowicz W，Bhattacharyya SN，Sonenberg N.Mechanisms of posttranscriptiona1regulation by microRNAs：are the answers insight？［J］.Nat Rev，2008，9（2）：102－114.

［14］孫建國，廖榮霞，周度金，等.基于基因芯片的乳腺癌干細胞 miRNAs檢測分析［J］.重慶醫學，2007，36（13）：1280－1282.

［15］黃秀芳，邵建永，顏黎栩，等.乳腺癌差異表達的miRNA的篩選研究［J］.中山大學學報，2009，30（1）：69－73.