甘露醇對小鼠腦缺血再灌注后環氧化酶－2表達的影響

董寶花，趙嘉訓

20%甘露醇注射液作為治療腦水腫、降低顱內壓的常用藥在臨床廣泛應用，特別是在急救心肺腦復蘇過程中的治療中尤其重要。目前，關于甘露醇在心肺腦復蘇中最佳給藥時間上沒有給予應有的關注，本課題利用郗東峰等[1]報道的小鼠腦缺血再灌注損傷模型，于再灌注后不同時間點采用甘露醇干預，觀察其對小鼠腦海馬CA1區細胞內環氧化酶－2（COX－2）表達情況的影響，從而為臨床救治過程中心肺腦復蘇提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康昆明小鼠36只，體重（35±5）g，雌雄隨機，清潔級。本次實驗隨機分為6組，每組6只。假手術組分離雙側頸總動脈，穿線，但不結扎；缺血再灌注損傷組分離雙側頸總動脈，穿線結扎1 h后再灌注，但不給藥；甘露醇即刻干預組、甘露醇30 min干預組、甘露醇1 h干預組、甘露醇1.5 h干預組分離雙側頸總動脈，結扎1 h后再灌注，分別在再灌注即刻、30 min、1 h和1.5 h尾靜脈注射20%甘露醇1 g/kg。

1.2 主要藥品及試劑 20%甘露醇注射液（石家莊四藥有限公司，批準文號：國藥準字 H13023007，批號：090217404），兔多抗COX－2多克隆抗體、生物素標記的山羊抗兔IgG、SABC、DAB顯色試劑盒、5%BSA封閉液（武漢博士德公司）。

1.3 模型制備 采用郗東風等[1]報道的昆明小鼠雙側頸總動脈結扎腦缺血再灌注損傷模型，造模成功后分別用HE和COX－2免疫組化染色。

1.4 計算機圖像分析 用數碼成像儀在顯微鏡下采集圖片，拍攝圖像，所得圖像采用BI2000醫學圖像分析系統進行圖像半定量分析，在400倍光學顯微鏡下，取病灶周圍5個不重復高倍鏡視野，測定細胞中棕黃色和棕褐色陽性表達顆粒的平均光密度（OD）值，取其平均值作為結果，越高表示蛋白表達越強。

2 結 果

2.1 細胞組織形態學表現 假手術組：海馬CA1區錐體細胞有層次分明的4～5層細胞結構，胞質均質紅染，核大而圓，細胞層向心側間質呈纖維束樣結構，排列整齊。缺血再灌注損傷組：正常錐體細胞數明顯減少，可見大量的變性壞死細胞形成的壞死灶，胞漿內有空泡形成。細胞層排列散亂。細胞間質變性，神經索模糊不清。甘露醇即刻干預組：絕大多數椎體細胞保持正常形態，4層～5層細胞結構完好。纖維結構清晰可辨。細胞間可見少數的固縮、深染的細胞核，比較A組細胞腫脹，胞質疏松。甘露醇30 min、1 h、1.5 h干預組：細胞層排列散亂。雖然較缺血再灌注損傷組間質水腫有所改善，但纖維樣結構凌亂不清晰，并有斷續現象。變性和壞死細胞數較多。

2.2 COX－2在腦組織的表達 假手術組幾乎不見海馬CA1區錐體細胞表達COX－2的陽性細胞；缺血再灌注損傷組可見大量棕黃色陽性細胞；甘露醇干預組部分血管內皮細胞及海馬區部分神經元表達COX－2的陽性；甘露醇30 min、1 h、1.5 h干預組海馬CA1區神經元陽性細胞顯著增多，著色加深。

2.3 平均光密度（OD）值 甘露醇即刻干預組海馬CA1區平均光密度值低于缺血再灌注組（P＜0.05）；與假手術組比較無統計學意義（P＞0.05）；甘露醇30 min、1 h、1.5 h干預組與缺血再灌注組比較無統計學意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 各組小鼠海馬CA1區平均光密度值的比較（±s）

表1 各組小鼠海馬CA1區平均光密度值的比較（±s）

與缺血再灌注組比較，1）P＜0.05

平均光密度值假手術組組別0.209 5±0.015 6缺血再灌注組 0.326 8±0.024 8甘露醇即刻干預組 0.213 2±0.010 51）甘露醇30 min干預組 0.319 3±0.108 4甘露醇1 h干預組 0.324 8±0.006 8甘露醇1.5 h干預組 0.324 8±0.004 2

3 討 論

醫學急救中腦復蘇環節是保證遠期復蘇效果的關鍵。近年來腦保護方法的研究分為缺血前處理[2]和缺血后處理[3]，現階段多數對腦缺血再灌注損傷干預措施的研究集中于缺血再灌注損傷發生前的預處理，由于臨床意外難以預見，預處理的方法常常無助于臨床意外腦損傷的救治，因此，近年來相關研究越來越關注缺血再灌注損傷后的醫學救治。鑒于腦缺血再灌注后壞死、凋亡、過氧化物、鈣超載等細胞病理機制的不可逆性，醫學研究應該關注細胞的可逆性病理損害，以組織細胞水腫變性病變作為觀察對象更具有現實意義。

2008年郗東鋒等[1]報道了昆明小鼠前腦缺血再灌注損害實驗動物模型制備方法，該實驗動物模型與其他同類研究的動物模型相比成本低廉，簡單易行，成功率高，重復性好，且損傷程度適中，可以通過組織水腫變性病變作為觀察指標，獲得腦缺血再灌注損傷救治的相關研究結果。2009年王雪紅等[4]和邢春平等[5]分別采用該動物模型評價了納洛酮和地塞米松的救治效果。2010年郭文義等[6]采用該動物模型發現，再灌注即刻甘露醇干預具有顯著的腦保護作用，但再灌注30 min以后給予甘露醇基本無效。

環氧合酶（COX）是催化花生四烯酸合成前列腺素和血栓素的限速酶，能引起炎癥反應并介導炎癥細胞毒性。在正常情況下，哺乳動物腦內不表達COX－2，在缺血和缺氧引起的炎癥反應中，COX－2表達增高，主要在神經元和血管內皮細胞表達[7]。COX－2在神經組織中的表達可直接損傷神經元，并引起細胞損傷和腦水腫[8]。

本課題同樣采用郗東鋒等[1]報道的昆明小鼠前腦缺血再灌注損害實驗動物模型，觀察缺血再灌注后不同時間甘露醇干預對COX－2表達的影響。觀察結果表明，再灌注即刻甘露醇干預可使小鼠海馬CA1區細胞形態，組織結構接近正常，無間質水腫表現，CA1區神經細胞COX－2表達平均光密度值明顯低于缺血再灌注組（P＜0.05），而與假手術組比較無統計學意義（P＞0.05）。說明早期應用甘露醇建立反相滲透壓梯度，能夠有效對抗血壓梯度對組織細胞水分布的驅動力，可有效防止COX－2的表達，發揮腦保護的作用。但再灌注30 min后給予甘露醇干預的效果不明顯，且COX－2蛋白表達增多、光密度值增高，與缺血再灌注對照組比較均無統計學意義（P＞0.05），說明甘露醇對COX－2表達并無直接作用。表明再灌注30 min后，一些不可逆的細胞損害機制一旦啟動，再給予甘露醇救治基本無效，觀察結果與郭文義的研究結果一致。

本研究提示臨床心肺復蘇救治中在有效血壓梯度建立的同時應該盡快給予甘露醇建立反相的滲透壓梯度，防止腦水腫的發生，阻斷不可逆細胞損害機制的啟動。水腫與不可逆細胞損害機制之間存在哪些病理鏈接，相關病理過程的標志物及其阻斷方法應該成為今后腦缺血再灌注研究的努力方向。

[1] 郗東鋒，郭晉鐸，程周軍，等.小鼠前腦缺血再灌注損傷模型海馬CA1區的形態學觀察[J].山西醫科大學學報，2008，39（3）：197－199.

[2] Zhao H，Sapolsky RM，Steinberg GK.Interrupting reperfusion as a stroke therapy：Ischemic postconditioning reduces infarct size after focal ischemia in rats[J].J Cereb Blood Flow Metab，2006，26（9）：1114－1121.

[3] Zhao ZQ，Corvera JS，Halkos ME，et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion：Comparison with ischemic preconditioning[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，285（2）：H579－H588.

[4] 王雪紅，趙嘉訓.納洛酮對小鼠海馬CA1區神經元缺血再灌注損傷干預效果的觀察[J].中國藥物與臨床，2009，9（11）：1057－1059.

[5] 邢春平，趙嘉訓.小鼠腦缺血再灌注后地塞米松對海馬CA1區神經細胞形態學的影響[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2010，8（2）：196－197.

[6] 郭文義，賀平，薛立超，等.甘露醇對腦缺血/再灌注損傷后干預效果評價的實驗研究[J].國際麻醉學與復蘇雜志，2011，32（6）：647－649.

[7] Nogawa S，Zhang F，Ross ME，et al.Cyclooxygenase－2 gene expression in neurons contributes to ischemic brain damage[J].Neurosc，1997，17（8）：2746.

[8] 劉宏，吳平生.全腦缺血再灌注后發生遲發性神經元死亡的機制[J].國外醫學：生理、病理科學與臨床分冊，1999，19（5）：379.