萱草花莖離體培養與快速繁殖

畢曉穎 王 寧

(沈陽農業大學，沈陽，110161)

萱草(Hemerocallis spp.)是百合科萱草屬的多年生草本花卉，其花型優美、花色豐富、葉叢美觀，適應廣泛的土壤和氣候條件，是世界上最重要的宿根花卉之一，具有很高的經濟價值和廣闊的應用前景［1－2］。近年來，隨著生態節約型園林理念的倡導，宿根花卉越來越受重視，人們對萱草新品種的需求也越來越大。但目前國內應用的萱草品種大多引自國外［3－4］，價格昂貴，種源有限，且種苗生產以傳統分株繁殖為主，繁殖系數低，因此，很難在短時間內獲得大量優質種苗，嚴重地限制了其在園林中的廣泛應用。

離體再生培養是植物大規模微體繁殖和遺傳轉化研究的技術保障［5－6］。目前已報道了萱草通過花莖［7－10］、葉片［11］、原生質體［12］等途徑再生完整植株，但研究主要集中在‘金娃娃’等少數品種上，而且不同品種的結果不盡相同［13－15］。基因型是影響植物再生體系建立的關鍵因素之一。萱草遺傳背景復雜，品種資源豐富，截止2009年，僅在美國萱草協會登錄的品種就達64 329個。因此，不同品種間基因型的差異可能是影響萱草植株再生的首要因素。培養基中激素種類及質量濃度也是影響植株再生的重要因素之一。本研究以17個優良萱草品種為試材，建立萱草花莖離體再生體系，探討基因型及激素對萱草花莖離體再生植株的影響，為不同基因型萱草再生體系的建立和試管苗的工廠化生產奠定基礎。

1 材料與方法

試驗于2009年6月—2011年6月份在沈陽農業大學園藝學院組織培養室進行。供試17個萱草品種分別為‘金娃娃’(‘Stella De Oro’)、‘波旁之王’(‘Bourbon King’)、‘小酒杯’(‘Little Wine Cup’)、‘摩洛哥紅’(‘Marocco Red’)、‘波久’(‘Pojo’)、‘秋紅’(‘Autumn Red’)、‘杜 威’(‘Dewey Roquemore’)、‘走好運’(‘Bonanza’)、‘重瓣魏河’(‘Double River Wye’)、‘紫泉’(‘Purple Waters’)、‘層雪’(‘Ortic Snow’)、‘小野蜂’(‘Little Bumble Bee’)、‘盛夏紅酒’(‘Summer Wine’)、‘海爾范’(‘Frans Hals’)、‘喜歸來’(‘Happy Returns’)、‘娃娃 語’(‘Siloam Baby Talk’)、橙花’(‘Orange’)，試材均取自沈陽農業大學花卉基地，選用幼嫩花莖為外植體。

材料用流水沖洗20 min，然后在超凈工作臺內用70%酒精浸泡30 s，再用0.1%HgCl2浸泡8 min，然后用無菌水沖洗3～5次，置于三角瓶中備用。

初代培養:將‘金娃娃’萱草花莖外植體接種到附加不同質量濃度的6－BA、NAA、IBA的培養基上，每個處理9瓶，每瓶3個外植體，重復3次。用于篩選誘導愈傷組織及不定芽分化的最佳培養基。在 MS+6 －BA1.0 mg·L－1+NAA0.10 mg·L－1培養基上，接種花莖分枝處以上部分和分枝處以下部分，每個部位接種5瓶，每瓶3個外植體，重復3次，比較花莖不同部位離體培養再生效果。

將不同基因型萱草花莖分枝處以上部分接種在MS+6 － BA1.0 mg·L－1+NAA0.10 mg·L－1培養基上，每個處理接種5瓶，每瓶2個外植體，重復3次。4周時統計愈傷組織誘導率和不定芽分化率。愈傷組織誘導率=(形成愈傷組織外植體數/接種外植體數)×100%，不定芽分化率=(分化不定芽外植體數/形成愈傷組織外植體數)×100%。

繼代增殖培養:將金娃娃初代培養的芽叢轉移到附加不同質量濃度的6－BA、NAA、IBA的培養基上，每個處理接種9瓶，重復3次。用于篩選繼代增殖培養最適合的培養基。

在 MS+6 －BA2.0 mg·L－1+IBA1.0 mg·L－1培養基上分別接種不同基因型初代培養的芽叢，每個處理接種9瓶，重復3次。繼代培養30 d后統計叢生芽的增殖系數。增殖系數=不定芽增殖總數/接種不定芽數。

生根培養:將生長健壯，高5 cm左右的試管苗轉接到1/2MS附加不同質量濃度NAA和IBA的生根培養基上，每個處理接種5瓶，每瓶3個外植體，重復3次。15 d后調查生根率、生根條數及根長度。生根率=(生根的無根苗個數/接種的無根苗總個數)×100%。

煉苗移栽:當試管苗根長1.5 cm左右時，將三角瓶封口膜逐漸打開，煉苗3 d后移栽到河沙中。20 d后調查移栽成活率。成活率=(成活苗數/移栽總苗數)×100%。

培養條件:以MS為基本培養基，附加3.0%蔗糖、5.0 g·L－1瓊脂，pH=5.8，培養溫度(25 ±2)℃，光照強度20 ～30 μmol·m－2·s－1，光照時間 12 h·d－1。

應用DPS7.05統計軟件中完全隨機設計單因素統計鄧肯氏新復極差顯著性分析處理數據。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對花莖愈傷組織誘導及不定芽分化的影響

接種數天后，外植體均有不同程度膨大和翻卷，15 d后開始有愈傷組織產生并逐漸分化出不定芽。附加IBA的培養基誘導出的愈傷組織濃綠色、致密，附加NAA的培養基誘導出的愈傷組織黃白色、疏松。由表1可知，NAA比IBA更有利于愈傷組織的誘導和分化，當6－BA的質量濃度為1.0 mg·L－1，NAA 的質量濃度為 0.05 mg·L－1或 0.10 mg·L－1時，愈傷組織誘導率和不定芽的分化率最高，分別為 67.9%和 80.0%、70.4% 和 84.2%，差異不顯著，但NAA的質量濃度為0.10 mg·L－1時分化出的不定芽數量更多，質量更好(圖1A)。因此，初代培養最適合的培養基為 MS+6－BA1.0 mg·L－1+NAA0.10 mg·L－1。

表1 不同培養基對‘金娃娃’萱草花莖外植體愈傷組織誘導及不定芽分化的影響

2.2 花莖不同部位對愈傷組織誘導及不定芽分化的影響

由表2可知，花莖不同部位外植體的愈傷組織誘導率和不定芽分化率差異顯著，花莖分枝處以上部分的愈傷組織誘導率和不定芽分化率分別為84.4%和92.1%，分枝處以下部分僅為37.8%和64.4%。由此可見，花莖分枝處以上部分是愈傷組織誘導及不定芽分化的最佳外植體部位。研究中還發現，花莖分枝處以上部分除了切口處產生愈傷組織外(圖1B)，分枝處也能產生愈傷組織并分化出不定芽(圖1C)。

表2 ‘金娃娃’萱草花莖不同部位對愈傷組織誘導及不定芽分化的影響

2.3 不同基因型花莖愈傷組織誘導及不定芽分化的差異

在 MS+6 －BA2.0 mg·L－1+IBA1.0 mg·L－1培養基上，16個萱草品種的花莖外植體接種10～15 d后均可以產生愈傷組織，但不同品種的愈傷組織誘導率差異顯著，愈傷組織的顏色、質地和生長速度也有所不同。如表3所示，‘秋紅’、‘波旁之王’和‘海爾范’的愈傷組織誘導率均在50%以上;‘重瓣魏河’和‘娃娃語’的愈傷組織誘導率最低，僅為6.7%。外植體接種20～30 d，愈傷組織不斷膨大，表面形成突起并且陸續分化出不定芽，其中‘波旁之王’、‘波久’、‘秋紅’、‘海爾范’的不定芽分化率均在80%以上;‘杜威’和‘盛夏紅酒’不定芽的分化率最低，只有16.7%和25.0%。不同基因型的不定芽質量和數量差別比較大，‘波旁之王’和‘小酒杯’每塊愈傷組織分化的不定芽數均在10株以上(圖1D、圖1E)，‘摩洛哥紅’每塊愈傷組織僅可以分化出2～3株不定芽(圖1F)。試驗發現，‘波旁之王’、‘波久’、‘秋紅’、‘海爾范’等品種80%以上的愈傷組織是在花梗分枝處產生的，并且很容易分化出不定芽。

圖1 萱草離體培養快速繁殖過程

表3 不同基因型萱草花莖外植體愈傷組織誘導及不定芽分化的差異

2.4 不同培養基對試管苗增殖的影響

由表4可知，不同培養基的試管苗增殖系數差異顯著，添加NAA的培養基顯著高于添加IBA的培養基。其中，MS+6 －BA2.0 mg·L－1+NAA0.10 mg·L－1培養基的增殖系數最高，為 5.5，但在添加NAA的培養基上，芽苗主要通過愈傷組織分化出不定芽的方式增殖，這類不定芽的整齊度和成活率較低，特別是多次繼代培養后，誘導出的乳白色愈傷組織結構松散，雖然能保持一定的分化率，但是成苗率逐漸降低。而在添加IBA的培養基上，芽叢的基部可以直接形成不定芽，這類不定芽健壯、整齊、生長迅速，其中MS+6－BA2.0 mg·L－1+IBA1.0 mg·L－1的增殖系數為 4.7(圖1G)。綜合考慮，繼代增殖最適合的培養基為MS+6 － BA2.0 mg·L－1+IBA1.0 mg·L－1。

表4 不同培養基對‘金娃娃’萱草試管苗增殖的影響

2.5 不同基因型萱草試管苗增殖的差異

由表5可知，不同品種的試管苗增殖系數差異顯著，試管苗的生長狀況也有差異，‘海爾范’的增殖系數最高，為5.2，試管苗葉色淺綠，長勢較好(圖1H);‘秋紅’的試管苗葉色濃綠，植株健壯;‘紫泉’的增殖系數雖然較高，但是部分植株呈現玻璃化;‘波久’增殖系數最低，為1.5，大部分植株葉片卷曲，長勢較差(圖1G)。

表5 不同基因型萱草試管苗增殖的差異

2.6 不同激素種類及質量濃度對試管苗生根的影響

萱草生根較為容易，但在不同培養基中的生根率、根數及根長度差異顯著。在附加IBA的培養基中，試管苗生根迅速，根黃白色、細長柔軟，不易折斷，組培苗較高且健壯;由表6可知，IBA質量濃度為3.0 mg·L－1時，試管苗生根率最高，為 93.3%，平均生根條數4.2條(圖1J)。在附加NAA的培養基中，試管苗基部有愈傷組織，生根緩慢，根白色，粗且脆，NAA質量濃度為0.10 mg·L－1時，生根率最高，為82.2%，平均根數為3.0條。因此，最適合的生根培養基為 1/2MS+IBA3.0 mg·L－1。

2.7 煉苗與移栽

使用河沙作為基質，試管苗移栽5 d后葉片變濃綠，移栽10 d后根系明顯伸長，并長出大量的側根，植株生長健壯(圖1K)，移栽成活率達98%以上。待小苗發新葉即可上盆移栽(圖1L)。

表6 不同激素種類及質量濃度對萱草試管苗生根的影響

3 結論與討論

很多萱草組織培養研究都采用花莖為外植體［16－18］，與莖尖或根等為外植體相比，花莖用作初代培養的外植體具有取材方便、材料豐富、易消毒、不損傷母本植株、能保存母本品種優良性狀、不定芽誘導率高等優點。但萱草為圓錐花序，花莖較長且存在分枝，具體是哪部分起作用不甚明了。文中的研究結果表明，其中起關鍵作用的是幼嫩花莖分枝以上部分，這與蘭麗婷［7］、倪新［19］和 Chen Jianxin［20］的研究結果一致，這樣在外植體的選擇上就更有準確性。

本研究發現，‘金娃娃’花莖外植體在不同激素種類及質量濃度配比的培養基上愈傷組織誘導率和不定芽分化率差異顯著，說明激素是影響萱草花莖離體再生的重要因素。將17個萱草品種的花莖分枝處以上部分作為外植體，接種在相同的培養基上，其愈傷組織誘導和不定芽分化能力表現出顯著差異，其中‘金娃娃’最高，其次是‘波旁之王’、‘秋紅’和‘海爾范’，‘重瓣魏河’和‘娃娃語’最低。可見，基因型也是影響萱草離體再生的重要因素之一，這與倪新［19］和宋雪蓮等［21］的研究結果相同。因此，今后應針對不同萱草品種進行系統的組織培養研究。

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