吲哚美辛預(yù)處理對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后炎癥反應(yīng)的影響

李和平 李惠勉

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450014)

腦缺血再灌注損傷的機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程。尋找一種抑制再灌注損傷的腦保護(hù)藥已成為醫(yī)學(xué)界的焦點(diǎn)。王巖等〔1〕認(rèn)為吲哚美辛對(duì)大腦有保護(hù)作用，但是作用機(jī)制臨床研究較少，本實(shí)驗(yàn)通過運(yùn)用大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型，觀察吲哚美辛預(yù)處理后對(duì)腦缺血再灌注損傷后腦組織海馬區(qū)中白介素IL-1β和C反應(yīng)蛋白(CRP)的影響，探討其腦保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康成年雄性SD大鼠84只，體質(zhì)量(300±50)g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;吲哚美辛片，由河南開封市永康藥業(yè)有限公司提供;免疫組化試劑盒購自RD公司，國內(nèi)分裝。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(28只)、模型組(28只)、吲哚美辛預(yù)處理組(28只)，每組于缺血后再灌注6、12、24、48 h又分為4個(gè)亞組，每組7只。

1.2.2 給藥 吲哚美辛預(yù)處理組術(shù)給予吲哚美辛水溶片(5 mg/kg)混懸液灌胃，1次/d連續(xù)3 d，根據(jù)體重計(jì)算吲哚美辛用量;假手術(shù)組和模型組均給予同等劑量生理鹽水灌胃。

1.2.3 模型制備 大鼠造模前禁食水8 h，稱重后用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)。根據(jù)改良Longa的線栓法，制作左側(cè)大鼠大腦中動(dòng)脈局灶性腦缺血再灌注模型，其成功的標(biāo)準(zhǔn)采用Longa神經(jīng)功能評(píng)分法，按神經(jīng)缺損輕重分為5級(jí):神經(jīng)功能正常為0級(jí);不能伸展右側(cè)前肢為1級(jí);向右側(cè)旋轉(zhuǎn)為2級(jí);向右側(cè)傾倒為3級(jí);無自主活動(dòng)伴意識(shí)喪失4級(jí)。0級(jí)和4級(jí)的被淘汰，1～3級(jí)的入選實(shí)驗(yàn)組，各亞組不成功者由替補(bǔ)組補(bǔ)充。

1.2.4 標(biāo)本制備 模型成立后，將大鼠于各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)麻醉后斷頭取腦，于4%多聚甲醛液中24 h后固定，并做組織切片，片厚約6～7μm。每組均取海馬區(qū)組織切片做HE染色，并采用免疫組織化S-P法染色且進(jìn)行DAB顯色，對(duì)組織標(biāo)本免疫組化結(jié)果進(jìn)行定量測(cè)定，步驟按免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)用x±s表示，使用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算，組間比較采用單因素方差分析

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 假手術(shù)組神經(jīng)功能均正常;模型組神經(jīng)功能缺損最重，各時(shí)間點(diǎn)缺損評(píng)分與假手術(shù)組比較有顯著性差異(P＜0.05);吲哚美辛預(yù)處理組神經(jīng)功能缺失評(píng)分降低，各時(shí)間點(diǎn)與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)。見表1。

2.2 腦組織病理特點(diǎn) 大體觀察，模型組與假手術(shù)組大鼠病灶腦組織的腫脹最為明顯，而吲哚美辛預(yù)處理組與模型組相比較，腦組織水腫有不同程度的減輕。HE染色后光鏡觀察:假手術(shù)組腦海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞輪廓清晰，排列整齊，細(xì)胞核大且圓，著色較淺，細(xì)胞核多于細(xì)胞中央，偶可見嗜酸性核仁;模型組神經(jīng)細(xì)胞輪廓模糊，排列紊亂，胞核小、著色變深，胞質(zhì)分界不清;吲哚美辛預(yù)處理組神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚清晰，胞核與胞質(zhì)尚能分清，提示吲哚美辛起到了神經(jīng)保護(hù)作用。

2.3 免疫組化染色結(jié)果 IL-1β和CRP于假手術(shù)組均可見極少量陽性細(xì)胞表達(dá)，缺血再灌注6 h后兩者的表達(dá)開始增高，于24 h達(dá)高峰，48 h開始下降，各時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組比較均明顯增高(P＜0.05);吲哚美辛預(yù)處理組各時(shí)間點(diǎn)與模型組相比，兩者的表達(dá)都明顯減少(P＜0.05)。見表2，表3。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺失評(píng)分(x ± s，n=7)

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)CRP的表達(dá)(x ± s，n=7)

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)IL-1β的表達(dá)(x ± s，n=7)

3 討論

近年來研究認(rèn)為腦缺血再灌注損傷機(jī)制主要與炎癥反應(yīng)、氧自由基形成、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、興奮性氨基酸的毒性作用、一氧化氮(NO)的過多釋放、細(xì)胞凋亡等因素有關(guān)〔2〕，以上因素之間又相互聯(lián)系，并共同作用參與腦缺血再灌注損傷的過程，其中炎癥反應(yīng)是腦缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展十分重要的環(huán)節(jié)。

研究表明腦缺血誘導(dǎo)白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等釋放炎性細(xì)胞因子如IL-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-8(IL-8)，黏附因子、血小板活化因子(PAF)和一些炎癥介質(zhì)如前列腺素和NO等〔3〕，這些炎性因子的生成是造成缺血損傷向炎癥損傷發(fā)生的基礎(chǔ)，同時(shí)這些炎性因子可激活白細(xì)胞黏附到腦缺血區(qū)微血管內(nèi)皮細(xì)胞上，造成內(nèi)皮細(xì)胞的皺縮、壞死，破壞血-腦脊液屏障(BBB)，加重腦缺血再灌注區(qū)的損傷。此外，在腦缺血再灌注時(shí)，細(xì)胞因子IL-1β等又可以促進(jìn)趨化因子和黏附因子的上調(diào)，促使白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附進(jìn)一步加強(qiáng)，從而形成級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)。Vila等〔4〕研究表明IL-1β是缺血再灌注損傷后較早表達(dá)的炎癥細(xì)胞因子之一，腦缺血發(fā)生后24 h內(nèi)，就可以在患者的腦脊液和血清中顯著升高，且與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。IL-1β主要存在于腦組織中，具有多方面生物學(xué)功能，在正常的腦組織中表達(dá)很少，而缺血再灌注時(shí)則明顯升高。導(dǎo)致?lián)p傷的機(jī)制主要為:增加興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性;增加神經(jīng)細(xì)胞鈣離子超負(fù)載，加速神經(jīng)細(xì)胞死亡;刺激其他多種炎癥因子及炎癥介質(zhì)的釋放;誘導(dǎo)神經(jīng)元基因的表達(dá)，促使細(xì)胞凋亡。本結(jié)果表明IL-1β在腦缺血再灌注后腦組織局部炎癥反應(yīng)起關(guān)鍵作用。

臨床研究業(yè)已證明，CRP可以認(rèn)為是炎癥反應(yīng)等引起的急性非特異性敏感標(biāo)志物，CRP水平的高低與腦缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng)及預(yù)后呈正相關(guān)〔5，6〕。而 Mueller 等〔7〕研究表明CRP不僅直接參與炎癥反應(yīng)的過程，并且可作為評(píng)估指標(biāo)來反映炎癥的程度。Peps等〔8〕研究顯示在急性炎癥反應(yīng)6～8 h內(nèi)CRP迅速升高，可達(dá)到正常水平的幾百倍甚至更高，并在48～72 h達(dá)到高峰，隨著炎癥反應(yīng)的減輕，CRP也降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果和其基本一致CRP可敏感地反映缺血再灌后的炎癥反應(yīng)動(dòng)態(tài)變化。同時(shí)Peps等〔8〕研究認(rèn)為CRP導(dǎo)致腦缺血再灌注損傷的機(jī)制可能為:活化自身受體;激活補(bǔ)體系統(tǒng);誘導(dǎo)黏附分子、單核細(xì)胞組織因子及內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá);激活炎性細(xì)胞因子IL-1β等的釋放。

Hartl等〔9〕認(rèn)為通過干預(yù)炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過程，就能降低腦缺血再灌注腦損傷的進(jìn)程。吲哚美辛為非甾體抗炎藥，具有很強(qiáng)的抗炎作用，臨床主要用來治療關(guān)節(jié)炎，偏頭痛等，其作用機(jī)制為抑制環(huán)氧合酶活性而減少前列腺素的合成，抑制炎性反應(yīng)，制止炎癥組織痛覺神經(jīng)沖動(dòng)的形成，并且抑制溶酶體酶的釋放和白細(xì)胞的趨化作用等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明炎性反應(yīng)參與了腦缺血再灌注損傷的病理過程;而預(yù)先給予吲哚美辛干預(yù)后，大鼠神經(jīng)缺損評(píng)分減低，腦水腫減輕，IL-1β，CRP明顯降低，提示吲哚美辛具有一定腦保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過抑制缺血再灌注區(qū)腦組織中炎癥因子IL-1β、CRP的表達(dá)有關(guān)，為吲哚美辛治療腦缺血再灌注損傷提供理論支持。

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