結(jié)直腸癌缺失基因功能區(qū)誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡

張旭浩 焦海展 吳亞冉 張凱峰 門麗慧 趙 青 韓 博 鞏春玲 叢中一

(吉林大學(xué)藥學(xué)院再生醫(yī)學(xué)系，吉林 長春 130021)

調(diào)查結(jié)果表明老年人(≥65歲)占結(jié)直腸癌病人的54.00%，老年人直腸癌和結(jié)腸癌發(fā)病率分別為49.81/10萬和63.35/10萬，為結(jié)直腸癌的高發(fā)人群〔1〕，所以結(jié)直腸癌的預(yù)防和治療對于人類的健康特別是對于老年人至關(guān)重要。研究表明，結(jié)直腸癌缺失(DCC)基因的缺失可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，而DCC基因的表達(dá)在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面具有重要作用;同時(shí)，有報(bào)道17p和18q基因在遠(yuǎn)地轉(zhuǎn)移腫瘤中缺失的幾率很高且可以看到多對等位基因片段的缺失〔2〕。本實(shí)驗(yàn)主要研究DCC基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 氨芐青霉素、卡那霉素購自北京華美生物工程公司;細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨及酵母提取物購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;細(xì)胞培養(yǎng)用胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶購自GIBCO公司;Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司;結(jié)腸癌細(xì)胞SW1116由本室保存;pIRES2-EGFP質(zhì)粒以及含有DCC基因胞內(nèi)功能域(3 727～3 792 bp)的重組表達(dá)載體pIRES2-EGFP-DCC為本實(shí)驗(yàn)室保存;TUNEL試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將SW1116細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中(含有10%FBS、100 U/ml青/鏈霉素)，0.25%胰酶消化、傳代。

1.3 pIRES2-EGFP-DCC脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染SW1116細(xì)胞 將SW1116細(xì)胞按5×103/孔接種于96孔板，分為3組(實(shí)驗(yàn)組、質(zhì)粒對照組、細(xì)胞對照組)，每組6個(gè)平行孔，待細(xì)胞貼壁并生長至占板底面積40% ～50%，將4μl Lipofectamine 2000與96μl無雙抗無血清培養(yǎng)基混合，室溫孵育5 min。然后將pIRES2-EGFP-DCC與pIRES2-EGFP各2μl與48μl無雙抗無血清培養(yǎng)基混合，分別加入上述 Lipofectamine 2000稀釋液50μl，混合，37℃孵育10 min。實(shí)驗(yàn)組96孔板每孔加入 Lipofectamine 2000和pIRES2-EGFP-DCC混合液10μl，24孔板每孔加入100μl;質(zhì)粒對照組96孔板每孔加入Lipofectamine 2000和pIRES2-EGFP混合液10μl，24孔板每孔加入100μl。5 h后換無雙抗有血清培養(yǎng)液，細(xì)胞對照組不做處理。

1.4 四甲基耦氮唑鹽(MTT)比色法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖情況轉(zhuǎn)染36 h后，于每孔加入10μl MTT(5 mg/ml)。于37℃孵育4 h后棄掉培養(yǎng)液，加入150μl DMSO，搖床震蕩15 min，酶標(biāo)儀檢測490 nm每孔吸光度OD值。記錄數(shù)據(jù)并計(jì)算細(xì)胞生長抑制率，抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/細(xì)胞對照組OD值)×100%。

1.5 吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)染色法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡情況轉(zhuǎn)染36 h后，于每孔加入AO、EB的等體積混合液2μl，室溫避光染色10 min，激發(fā)波長510 nm，熒光顯微鏡下照相觀察。鏡下隨機(jī)取5個(gè)不重復(fù)的視野，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中凋亡及壞死細(xì)胞，分別計(jì)算細(xì)胞凋亡率及壞死率。

1.6 原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡情況 轉(zhuǎn)染36 h后，方法按稍加修改的TUNEL檢測試劑盒說明書進(jìn)行，使用TUNEL原位檢測試劑盒對凋亡細(xì)胞進(jìn)行原位染色。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，參數(shù)統(tǒng)計(jì)采用異方差t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MTT比色法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖情況 實(shí)驗(yàn)組、細(xì)胞對照組、質(zhì)粒對照組的細(xì)胞增殖分別為0.599±0.037，0.735±0.031，0.675±0.020，可見轉(zhuǎn)染 pIRES2-EGFP-DCC 36 h后，MTT結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染DCC基因功能區(qū)對SW1116細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，抑制率為32.1%，三組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 AO/EB染色法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡情況 轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-DCC 36 h后，AO/EB熒光染色結(jié)果如圖1所示，實(shí)驗(yàn)組中可見大量激發(fā)黃色熒光的凋亡晚期細(xì)胞，而質(zhì)粒對照組和細(xì)胞對照組中基本沒有，表明轉(zhuǎn)染DCC基因功能區(qū)可以明顯誘導(dǎo)SW1116細(xì)胞凋亡。

2.3 TUNEL法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡情況 TUNEL法結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組中可見大量被染成棕褐色的凋亡細(xì)胞，而質(zhì)粒對照組和細(xì)胞對照組中基本沒有，見圖2。表明DCC基因功能區(qū)的表達(dá)可以明顯誘導(dǎo)SW1116細(xì)胞凋亡。

圖1 轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-DCC的SW1116細(xì)胞AO/EB染色熒光照片(×100)

圖2 轉(zhuǎn)染p IRES2-EGFP-DCC的SW1116細(xì)胞TUNEL檢測照片(×200)

3 討論

DCC基因是Fearon等〔3〕在研究結(jié)直腸腫瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)并命名的一個(gè)抑癌基因，編碼由1 447個(gè)氨基酸組成的跨膜蛋白，其胞外區(qū)為神經(jīng)生長因子-1(Netrin-1)受體，胞內(nèi)區(qū)含有324個(gè)氨基酸，氨基端有25個(gè)疏水性氨基酸構(gòu)成的信號序列，緊接著信號序列之后是4個(gè)免疫球蛋白樣C2結(jié)構(gòu)域，之后便是6個(gè)Ⅲ型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域。該基因定位于18號染色體長臂(18q21.3)。

研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中DCC基因缺失率在70%以上〔4〕;Gal等〔5〕在其研究中發(fā)現(xiàn)，對于 DCC 蛋白表達(dá)陽性的病人，當(dāng)輔助于化療時(shí)，可使生存率大大提高。將DCC反義RNA轉(zhuǎn)染纖維母細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞生長失控，體內(nèi)注射對裸鼠具有致瘤性〔6〕。將DCC基因轉(zhuǎn)染到結(jié)腸癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞生長受到抑制，體內(nèi)注射對裸鼠的致瘤性降低〔7，8〕。這些研究表明，DCC基因的表達(dá)可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

隨后Mazelin等〔9〕發(fā)現(xiàn)，DCC對腫瘤的抑制作用是通過有條件誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。Mehlen等〔10〕研究表明，DCC蛋白是一種依賴性受體，在配體Netrin-1存在時(shí)則具有抗凋亡作用，在配體缺乏時(shí)可以誘導(dǎo)凋亡。Mehlen等〔10〕進(jìn)一步將DCC胞內(nèi)區(qū)(DCC-IC)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Caspases活性明顯增加;體外Caspases孵育實(shí)驗(yàn)表明，DCC-IC在1 290 bp處被Caspases斷裂;將斷裂位點(diǎn)區(qū)域DCC-IC/1 121～1 290轉(zhuǎn)染293T可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;進(jìn)一步體外突變研究發(fā)現(xiàn)DCC-IC/1 243～1 264區(qū)段對于誘導(dǎo)凋亡是必需的。這些研究表明，DCC蛋白的腫瘤抑制作用是通過在配體Netrin-1缺乏時(shí)經(jīng)Caspases通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的，而且其活性功能域很可能就是DCC-IC/1 243～1 264。DCC基因失活導(dǎo)致Bcl-2/Bax反常表達(dá)，抑制凋亡發(fā)生，可作為DCC基因凋亡分子機(jī)制之一〔11〕。

本研究通過脂質(zhì)體法將含有DCC基因胞內(nèi)區(qū)功能域(3 727～3 792 bp)的重組表達(dá)載體pIRES2-EGFP-DCC轉(zhuǎn)染到結(jié)腸癌細(xì)胞SW1116，轉(zhuǎn)染目的片段的實(shí)驗(yàn)組與對照組相比細(xì)胞增殖明顯受到抑制;且實(shí)驗(yàn)組通過AO/EB法和TUNEL法分別檢測到大量凋亡細(xì)胞，而對照組沒有，證明該片段具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的功能，為進(jìn)一步研究DCC基因誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制打下了基礎(chǔ)。

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10 Mehlen P，Rabizadeh S，SniPas SJ，et al.The DCCgene product induces apoptosis by a mechanism requiring receptor proteolysis〔J〕.Nature，1998;395:801.

11 楊 莉，孫明軍.DCC基因失活與大腸癌發(fā)病及與Bcl-2、Bax表達(dá)的相關(guān)性研究〔D〕.沈陽:中國醫(yī)科大學(xué)碩士論文，2007.