結直腸癌缺失基因功能區誘導結腸癌細胞凋亡

張旭浩 焦海展 吳亞冉 張凱峰 門麗慧 趙 青 韓 博 鞏春玲 叢中一

(吉林大學藥學院再生醫學系，吉林 長春 130021)

調查結果表明老年人(≥65歲)占結直腸癌病人的54.00%，老年人直腸癌和結腸癌發病率分別為49.81/10萬和63.35/10萬，為結直腸癌的高發人群〔1〕，所以結直腸癌的預防和治療對于人類的健康特別是對于老年人至關重要。研究表明，結直腸癌缺失(DCC)基因的缺失可以導致腫瘤的發生，而DCC基因的表達在誘導腫瘤細胞凋亡方面具有重要作用;同時，有報道17p和18q基因在遠地轉移腫瘤中缺失的幾率很高且可以看到多對等位基因片段的缺失〔2〕。本實驗主要研究DCC基因對結腸癌細胞的凋亡誘導作用。

1 材料與方法

1.1 材料 氨芐青霉素、卡那霉素購自北京華美生物工程公司;細菌培養用胰蛋白胨及酵母提取物購自上海生工生物工程技術服務有限公司;細胞培養用胎牛血清(FBS)、DMEM培養基和胰蛋白酶購自GIBCO公司;Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司;結腸癌細胞SW1116由本室保存;pIRES2-EGFP質粒以及含有DCC基因胞內功能域(3 727～3 792 bp)的重組表達載體pIRES2-EGFP-DCC為本實驗室保存;TUNEL試劑盒購自碧云天生物技術研究所。

1.2 細胞培養 將SW1116細胞在37℃、5%CO2條件下培養于DMEM培養基中(含有10%FBS、100 U/ml青/鏈霉素)，0.25%胰酶消化、傳代。

1.3 pIRES2-EGFP-DCC脂質體法轉染SW1116細胞 將SW1116細胞按5×103/孔接種于96孔板，分為3組(實驗組、質粒對照組、細胞對照組)，每組6個平行孔，待細胞貼壁并生長至占板底面積40% ～50%，將4μl Lipofectamine 2000與96μl無雙抗無血清培養基混合，室溫孵育5 min。然后將pIRES2-EGFP-DCC與pIRES2-EGFP各2μl與48μl無雙抗無血清培養基混合，分別加入上述 Lipofectamine 2000稀釋液50μl，混合，37℃孵育10 min。實驗組96孔板每孔加入 Lipofectamine 2000和pIRES2-EGFP-DCC混合液10μl，24孔板每孔加入100μl;質粒對照組96孔板每孔加入Lipofectamine 2000和pIRES2-EGFP混合液10μl，24孔板每孔加入100μl。5 h后換無雙抗有血清培養液，細胞對照組不做處理。

1.4 四甲基耦氮唑鹽(MTT)比色法檢測轉染后細胞增殖情況轉染36 h后，于每孔加入10μl MTT(5 mg/ml)。于37℃孵育4 h后棄掉培養液，加入150μl DMSO，搖床震蕩15 min，酶標儀檢測490 nm每孔吸光度OD值。記錄數據并計算細胞生長抑制率，抑制率=(1-實驗組OD值/細胞對照組OD值)×100%。

1.5 吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)染色法檢測轉染細胞凋亡情況轉染36 h后，于每孔加入AO、EB的等體積混合液2μl，室溫避光染色10 min，激發波長510 nm，熒光顯微鏡下照相觀察。鏡下隨機取5個不重復的視野，計數200個細胞中凋亡及壞死細胞，分別計算細胞凋亡率及壞死率。

1.6 原位末端標記法(TUNEL)檢測轉染細胞凋亡情況 轉染36 h后，方法按稍加修改的TUNEL檢測試劑盒說明書進行，使用TUNEL原位檢測試劑盒對凋亡細胞進行原位染色。

1.7 統計學處理 應用SPSS11.5統計軟件進行數據處理，實驗數據以x±s表示，參數統計采用異方差t檢驗。

2 結果

2.1 MTT比色法檢測轉染細胞增殖情況 實驗組、細胞對照組、質粒對照組的細胞增殖分別為0.599±0.037，0.735±0.031，0.675±0.020，可見轉染 pIRES2-EGFP-DCC 36 h后，MTT結果顯示，轉染DCC基因功能區對SW1116細胞的增殖具有顯著的抑制作用，抑制率為32.1%，三組之間的差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 AO/EB染色法檢測轉染細胞凋亡情況 轉染pIRES2-EGFP-DCC 36 h后，AO/EB熒光染色結果如圖1所示，實驗組中可見大量激發黃色熒光的凋亡晚期細胞，而質粒對照組和細胞對照組中基本沒有，表明轉染DCC基因功能區可以明顯誘導SW1116細胞凋亡。

2.3 TUNEL法檢測轉染細胞凋亡情況 TUNEL法結果顯示，實驗組中可見大量被染成棕褐色的凋亡細胞，而質粒對照組和細胞對照組中基本沒有，見圖2。表明DCC基因功能區的表達可以明顯誘導SW1116細胞凋亡。

圖1 轉染pIRES2-EGFP-DCC的SW1116細胞AO/EB染色熒光照片(×100)

圖2 轉染p IRES2-EGFP-DCC的SW1116細胞TUNEL檢測照片(×200)

3 討論

DCC基因是Fearon等〔3〕在研究結直腸腫瘤時發現并命名的一個抑癌基因，編碼由1 447個氨基酸組成的跨膜蛋白，其胞外區為神經生長因子-1(Netrin-1)受體，胞內區含有324個氨基酸，氨基端有25個疏水性氨基酸構成的信號序列，緊接著信號序列之后是4個免疫球蛋白樣C2結構域，之后便是6個Ⅲ型纖連蛋白結構域。該基因定位于18號染色體長臂(18q21.3)。

研究發現結直腸癌組織中DCC基因缺失率在70%以上〔4〕;Gal等〔5〕在其研究中發現，對于 DCC 蛋白表達陽性的病人，當輔助于化療時，可使生存率大大提高。將DCC反義RNA轉染纖維母細胞，發現該細胞生長失控，體內注射對裸鼠具有致瘤性〔6〕。將DCC基因轉染到結腸癌細胞，發現該細胞生長受到抑制，體內注射對裸鼠的致瘤性降低〔7，8〕。這些研究表明，DCC基因的表達可以明顯抑制腫瘤細胞的增殖。

隨后Mazelin等〔9〕發現，DCC對腫瘤的抑制作用是通過有條件誘導細胞凋亡實現的。Mehlen等〔10〕研究表明，DCC蛋白是一種依賴性受體，在配體Netrin-1存在時則具有抗凋亡作用，在配體缺乏時可以誘導凋亡。Mehlen等〔10〕進一步將DCC胞內區(DCC-IC)轉染293T細胞，發現Caspases活性明顯增加;體外Caspases孵育實驗表明，DCC-IC在1 290 bp處被Caspases斷裂;將斷裂位點區域DCC-IC/1 121～1 290轉染293T可以誘導細胞凋亡;進一步體外突變研究發現DCC-IC/1 243～1 264區段對于誘導凋亡是必需的。這些研究表明，DCC蛋白的腫瘤抑制作用是通過在配體Netrin-1缺乏時經Caspases通路誘導細胞凋亡實現的，而且其活性功能域很可能就是DCC-IC/1 243～1 264。DCC基因失活導致Bcl-2/Bax反常表達，抑制凋亡發生，可作為DCC基因凋亡分子機制之一〔11〕。

本研究通過脂質體法將含有DCC基因胞內區功能域(3 727～3 792 bp)的重組表達載體pIRES2-EGFP-DCC轉染到結腸癌細胞SW1116，轉染目的片段的實驗組與對照組相比細胞增殖明顯受到抑制;且實驗組通過AO/EB法和TUNEL法分別檢測到大量凋亡細胞，而對照組沒有，證明該片段具有誘導腫瘤細胞凋亡的功能，為進一步研究DCC基因誘導細胞凋亡的機制打下了基礎。

1 Lei T，Fang L，Cheng WQ，et al.Analysis of epidemiological characteristics and trends of colorectal cancer among elderly patients in ten cities and counties in China〔J〕.Disease Surveillance，2009;24(6):429-33.

2 Reale MA，Hu G，Zafar AL，et al.Expression and alternative splicing of the deleted in colorectal cancer(DCC)gene in normal and malignant tissues〔J〕.Cancer Res，2007;54:4493-501.

3 Fearon ER，Cho KR，Nigro JM，et al.Identification of a chromosome 18q gene that is altered in colorectal cancers〔J〕.Science，1990;247(4938):49-56.

4 Vogelstein B，Fearon ER，Hamilton SR，et al.Genetic alterations during colorectal-tumor development〔J〕.N Engl JMed，1988;319:525-32.

5 Gal R，Sadikov E，Sulkes J，et al.Deleted in colorectal cancer Protein expression as a possible Predictor of response to adjuvant chemotherapy in colorectal cancer patients〔J〕.Dis Colon Rectum，2004;47(7):1216-24.

6 Narayanan R，Lawlor KG，Schaapveld RQ，et al.Antisense RNA to the putative tumor-suppressor gene DCC transforms Rat-1 fibroblasts〔J〕.Oncogene，1992;12:1387.

7 Goyette MC，Cho K，Fasching CL，et al.Progression of colorectal cancer is associated with multiple tumor suppressor gene defects but inhibition of tumorigenicity is accomplished by correction of any single defect via chromosome transfer〔J〕.Mol Cell Biol，1992;12:1387-95.

8 Tanaka K，Oshimura M，Kikuchi R，et al.Suppression of tumorigenicity in human colon carcinoma cells by introduction of normal chromosome 5 or 18〔J〕.Nature，1991;349:340-2.

9 Mazelin L，Bernet A，Bonod-Bidaud C，et al.Netrin-1 controls colorectal tumorigenesis by regulating apoptosis〔J〕.Nature，2004;431(7004):80-4.

10 Mehlen P，Rabizadeh S，SniPas SJ，et al.The DCCgene product induces apoptosis by a mechanism requiring receptor proteolysis〔J〕.Nature，1998;395:801.

11 楊 莉，孫明軍.DCC基因失活與大腸癌發病及與Bcl-2、Bax表達的相關性研究〔D〕.沈陽:中國醫科大學碩士論文，2007.