益氣養(yǎng)陰消癥通絡方對糖尿病腎病大鼠血管內皮生長因子信號通路的影響

郭立芳 王鳳麗 王月華 丁英鈞 陳志強

(河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050011)

糖尿病腎病(DN)是個漸進性的腎臟疾病且代表了糖尿病嚴重的晚期并發(fā)癥，目前仍缺乏有效的治療手段。我們以“久病入絡”理論為指導，提出氣陰兩虛、癥積絡阻為DN基本病機，以益氣養(yǎng)陰消癥通絡為DN的治療大法。而前期研究中我們已經證實該法能夠通過對DN大鼠TGF-β/Smads、氧化應激及RAS系統(tǒng)的影響發(fā)揮對DN的治療作用〔1～6〕。現(xiàn)代研究表明，足細胞及其裂孔隔膜上的裂孔膜蛋白與蛋白尿的發(fā)生密切相關，而血管內皮生長因子(VEGF)能增加腎小球濾過屏障對血漿蛋白的通透性，其過表達參與了DN蛋白尿的發(fā)生。因此本研究繼以DN動物模型，觀察益氣養(yǎng)陰消癥通絡法對DN大鼠VEGF信號轉導通路的影響，為中藥復方制劑延緩DN提供現(xiàn)代醫(yī)學理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗研究選用雄性SD大鼠70只，清潔級，體質量為(200±10)g，由河北醫(yī)科大學動物中心提供，合格證號:703058。

1.2 實驗藥物 益氣養(yǎng)陰消癥通絡中藥，由黃芪、玄參、地龍、鱉甲、丹參、大黃、烏梢蛇、水蛭、全蟲等組成，經粉碎、水煎濃縮至含生藥3 g/ml(河北醫(yī)科大學中醫(yī)院制劑室提供)。厄貝沙坦組予大鼠厄貝沙坦片(批號為0809155，由杭州賽諾菲圣德拉堡民生制藥有限公司生產)15 mg·kg-1·d-1。

1.3 方法

1.3.1 動物的分組及造模 選用雄性SD大鼠70只，適應性飼養(yǎng)1 w后，分別置代謝籠里取尿，測定尿蛋白及尿紅細胞全部陰性，60只大鼠均行腹腔注射STZ(55 mg·kg-1·d-1)一次，3 d后測空腹血糖≥16.7 mmol/L隨機分為模型組、中藥組及厄貝沙坦組，開始灌胃給藥。分別于實驗第4、8、12、16、20、24周于代謝籠里留取24 h尿量后，股動脈取血并取右側腎組織待測。

1.3.2 免疫組化方法檢測VEGF、Flt1的表達情況 脫水后常規(guī)石蠟包埋，制成蠟塊，切成5μm厚的連續(xù)切片，附于經多聚賴氨酸附膜的載玻片上。按照SP免疫組化染色試劑盒要求操作。半定量分析:采用多功能真彩色細胞圖像分析管理系統(tǒng)，進行400倍的顯微照相，每張切片鏡下隨機選取5個視野，在光亮度和放大倍數(shù)一致的條件下觀察腎臟陽性產物的分布、染色情況。

1.3.3 Western印跡方法檢測VEGF、Flt1的表達情況 用RIPA蛋白裂解液提取腎組織總蛋白，采用Bradford法測定蛋白濃度;取腎組織裂解蛋白50μg，經15%SDS-PAGE垂直凝膠電泳后，電轉移至PVDF膜;5%脫脂奶粉室溫封閉1 h;加一抗，4℃過夜，加二抗，室溫2 h，以上兩步后TBST洗膜10 min×3次;DAB顯色;Gene圖像分析儀攝像、分析，目的蛋白相對含量以目的蛋白/β-actin(內參)的灰度比值表示。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析，組間兩兩顯著性比較采用最小顯著差異(LSD)法。

2 結果

2.1 免疫組化方法檢測VEGF、Flt1的表達 VEGF主要表達于腎小球臟層上皮細胞，F(xiàn)lt1則主要表達于腎小球內皮細胞，在腎小球壁層上皮細胞也有部分表達。半定量分析顯示，模型組及兩治療組較正常組VEGF及Flt1的表達顯著升高(P＜0.01);厄貝沙坦組、中藥組與模型組相比，VEGF及Flt1的表達均顯著下降(P＜0.05);厄貝沙坦組與中藥組比較無明顯差異(P＞0.05)。見表1。

2.2 Western印跡方法檢測VEGF、Flt1的表達 與正常組比較，模型組及兩治療組 VEGF及Flt1的表達顯著升高(P＜0.01);與模型組比較，厄貝沙坦組及中藥組VEGF和Flt1的表達均顯著下降(P＜0.01);厄貝沙坦組與中藥組比較無顯著性差異(P＞0.05)。見表2。

表1 各組大鼠VEGF和Flt1蛋白表達半定量分析結果(x±s)

表2 各組大鼠VEGF和Flt1相對蛋白含量比較(x±s)

3 討論

我們認為DN的基本病機是氣虛無力運血而致血瘀;陰虛火旺，煎熬津液，津虧液少則血液黏稠不暢而致“陰虛血瘀”，病久不愈深伏于腎絡漸成微小癥積，致使腎體受損，腎用失司，導致DN的發(fā)生。據(jù)此，我們結合“病久必瘀、病久入絡”的中醫(yī)病理學理論，提出該病證病位在絡，“瘀血癥積阻于腎絡”可能是病機之關鍵，就在益氣養(yǎng)陰基礎上加水蛭、烏梢蛇、全蝎等化瘀消癥通絡蟲類藥物進行干預，并對該方治療DN進行了較為系統(tǒng)的臨床療效觀察，同時又進行了其對TGF-β/Smads、氧化應激及RAS系統(tǒng)等有關作用機制的基礎研究，均取得了滿意的治療效果〔1～6〕，進一步證實“瘀血癥積阻絡證”幾乎貫穿DN全過程。

既往研究認為，DN的主要病理特征是腎小球細胞外基質堆積、系膜增寬、基底膜增厚，腎小球硬化及腎間質纖維化。然而，這些因素僅能解釋30%～50%的尿蛋白排泄率和腎小球濾過率的變化〔7〕，而足細胞損傷則導致腎小球濾過膜完整性喪失和大量蛋白漏出〔8〕。足細胞足突間的裂孔隔膜的完整性是決定腎小球濾過屏障通透性的關鍵，而裂孔隔膜上的裂孔膜蛋白與蛋白尿的發(fā)生密切相關〔9〕。另外研究中發(fā)現(xiàn)，VEGF是迄今所發(fā)現(xiàn)最強大的血管通透因子，能增加腎小球濾過屏障對血漿蛋白的通透性。VEGF在腎臟組織中含量豐富，主要由腎小球足細胞合成分泌。糖尿病足細胞上VEGF過表達參與了尿蛋白的發(fā)生。研究也發(fā)現(xiàn)，高糖能通過如TGF-β、氧化應激等多種因素誘導足細胞VEGF表達上調，VEGF還能通過VEGF受體1(Flt1)信號通路，刺激足細胞產生GBM的主要成分，即Ⅳ型膠原 α3 鏈〔10～12〕。Wolf等〔13〕研究表明，血管緊張素Ⅱ可以刺激足細胞產生VEGF，隨后引起nephrin表達的減少和蛋白尿的形成。另在DN小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，腎小球內VEGF表達明顯增加、上皮細胞足突裂孔的密度下降，阻斷VEGF信號可部分恢復足突裂孔密度、防止腎小球基底膜增厚、減輕尿蛋白〔14〕。以上結果證明，VEGF自我調節(jié)體系在調節(jié)足細胞GBM成分中發(fā)揮重要作用。

本研究結果表明，益氣養(yǎng)陰消癥通絡法能夠通過對VEGF信號轉導通路的影響，發(fā)揮其延緩DN進程的作用。結合我們以前的研究成果，綜合分析益氣養(yǎng)陰消癥通絡法具有特定的多途徑、多靶點防治DN的細胞及分子調控機制。

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