Caspase-3參與白花敗醬草皂苷誘導Hela細胞凋亡

張 濤 田黎明 朱貴明 任繼秋 張 宇 田麗華

(佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007)

白花敗醬草是敗醬科草本植物的根莖及帶根全草，在中國的華東、華中、華南及西南各地均有分布，是一種常用植物藥。白花敗醬草具有清熱利濕、解毒排膿、活血化瘀、清心安神、改善肝功能、抑菌和抗病毒等作用。關于黃花敗醬體內抗腫瘤，體外誘導人乳腺癌(MCF-7)細胞凋亡的作用曾有報道〔1〕，但白花敗醬草及其總皂苷在抗腫瘤方面的作用，較少報道〔2〕。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑 人宮頸癌Hela細胞株由哈爾濱醫科大學微生物教研室贈送;RPMI-1640干粉培養基(美國Gibco公司);新生牛血清(杭州四季青公司);AB8大孔吸附樹脂購于天津南開大學化工廠。

1.2 方法

1.2.1 實驗藥材與處理 白花敗醬草購于秦皇島市民樂醫藥公司，由安國市昌達中藥材飲片有限公司提供。

1.2.1.1 白花敗醬草水提物的制備〔3〕白花敗醬草粉碎后加適量水，浸泡3 h，煮沸提取60 min，收集藥液，經旋轉蒸發儀50℃減壓回收得白花敗醬草水提液，真空干燥箱55℃干燥，得敗醬草水提物固體干粉。

1.2.1.2 白花敗醬草總皂苷的制備 取干燥的白花敗醬草4 kg，粉碎，按1∶10用70%食用酒精浸泡4 h，加熱回流提取2次，合并濾液減壓回收乙醇，得白花敗醬草乙醇粗提物。此粗提物加入石油醚脫脂，用AB8大孔吸附樹脂層析分離總皂苷。白花敗醬草醇提物上層析柱后用蒸餾水洗脫至洗脫液中無糖為止(Molish反應陰性)。再分別用30%、50%和70%乙醇洗脫，收集洗脫液，至各洗脫液Liberman-Burchard反應陰性為止。洗脫液減壓回收乙醇，真空干燥得淡黃色粗提物，終重量為25.2 g，白花敗醬草總皂苷的提取率約為0.63%。皂苷鑒定∶取少量干燥提取物，與濃硫酸-醋酐(1∶20)反應顯藍綠色，證明提取物為甾體皂苷〔3〕。

1.2.2 細胞培養 Hela細胞培養于含10%新生牛血清的RPMI-1640培養液，置于37℃，50 ml/L CO2、飽和濕度恒溫培養箱中孵育，每2～3 d傳代。

1.2.3 指標檢測

1.2.3.1 噻唑藍(MTT)法測定細胞增殖抑制作用 水提物終濃度分別為 0.20，0.40，0.80，1.20 mg/ml;皂苷終濃度分別為0.05，0.10，0.15，0.20 mg/ml。另設未加藥物只加細胞的對照組，每個濃度設三個復孔，誘導48 h。細胞生長抑制率=(1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值)×100%。根據各組藥物對細胞的抑制率，運用SPSS10.0軟件計算出藥物半數抑制濃度(IC50)。

1.2.3.2 光鏡觀察Hela細胞凋亡的形態學特征 皂苷0.15 mg/ml，水提物1.20 mg/ml，陰性對照組培養48 h后，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，4%多聚甲醛固定，4℃過夜。蘇木素-伊紅(H-E)染色，光鏡觀察拍照。

1.2.3.3 電鏡觀察Hela細胞超微結構的變化 用皂苷0.15 mg/ml處理Hela細胞48 h和72 h后，樹脂包埋，烘烤24 h固化成硬塊，切成超薄切片(50 nm)，醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙重染色后，透射電鏡觀察細胞超微結構。

1.2.3.4 Hela細胞Caspase-3活性的檢測 皂苷終濃度為0.15、0.20 mg/ml，水提物終濃度為 0.80、1.20 mg/ml，每個濃度設3個復孔，同時設陰性對照，按試劑盒說明書操作，酶標儀測定OD405值，通過計算OD給藥組/OD陰性對照的倍數來確定各組Caspase-3的活化程度。

1.3 統計學方法 應用SAS9.13軟件分析，實驗數據以x±s表示，組間差異的顯著性先方差分析，再采用Dunnet't檢驗。

2 結果

2.1 白花敗醬草皂苷和水提物對Hela細胞生長的抑制作用總皂苷和水提取物的 IC50值分別是 59.2μg/ml和199.9μg/ml。根據美國國家癌癥中心(NCI)標準:IC50≤230μg/ml可作為抗腫瘤藥物，說明白花敗醬草總皂苷和水提物對Hela細胞有明顯的細胞毒作用。見表1，表2。

2.2 白花敗醬草總皂苷誘導Hela細胞的形態學變化

2.2.1 HE染色光鏡觀察結果 光鏡下可見對照組的Hela細胞生長良好，細胞呈多邊形，細胞質多，胞核染色質疏松，染色較淡;皂苷0.15 mg/ml及水提物1.20 mg/ml誘導 Hela細胞48 h后，細胞生長受到不同程度的抑制，出現胞體變圓，胞質起泡，染色質凝集深染等。見圖1。

表1 白花敗醬草總皂苷對Hela細胞生長的抑制作用

表2 白花敗醬草水提物對Hela細胞生長的抑制作用

圖1 HE染色光鏡觀察結果(×100)

2.2.2 電鏡觀察結果 電鏡下可見對照組Hela細胞膜表面有較多微絨毛，染色質疏松，核仁明顯。皂苷0.15 mg/ml誘導Hela細胞48 h和72 h后，可見細胞變小，細胞膜表面微絨毛消失，出現早期細胞凋亡的染色體邊集，細胞質中空泡化明顯，可見含致密染色質和細胞膜的凋亡小體。見圖2。

圖2 電鏡觀察Hela細胞形態(TME，×6 000)

2.3 敗醬草皂苷和水提物對Hela細胞Caspase-3活性的影響用白花敗醬草總皂苷和水提物誘導Hela細胞48 h后，各誘導組Caspase-3活性比對照組均有顯著增高，總皂苷0.15 mg/ml和水提物1.2 mg/ml激活Caspase-3活性分別是對照組的3.70和2.42倍。見表3，表4。

表3 敗醬草總皂苷對Hela細胞Caspase-3活性的影響

表4 敗醬草水提物對Hela細胞Caspase-3活性的影響

3 討論

有研究表明多種皂苷具有明顯的抗腫瘤活性〔4，5〕，本實驗白花敗醬草總皂苷和水提物對Hela細胞生長均有明顯的抑制作用，表明Hela細胞對白花敗醬草皂苷的抑制作用敏感，初步確定皂苷是白花敗醬草有效的抗腫瘤活性成分。

誘導腫瘤細胞凋亡已成為腫瘤治療的新靶點。細胞凋亡時具有典型的形態和生化特征〔6〕。細胞凋亡受多種基因調控，并與Caspases家 族 和 Bcl-2家 族 密 切相關〔7〕。Caspases為半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶的簡稱，是一組具有相似氨基酸順序和二級結構的半胱氨酸蛋白酶，參與細胞因子成熟、細胞生長和分化，還與細胞凋亡密切相關。Caspases級聯反應在凋亡通路中處于重要地位，尤其 Caspase-3是其中的中心環節，Caspase-3被認為是細胞凋亡過程中最關鍵的效應蛋白酶，而Caspase-3催化一些底物的降解是導致染色質濃縮的關鍵步驟〔8〕。本實驗表明白花敗醬草總皂苷通過誘導Hela細胞的凋亡，達到其抑制腫瘤細胞生長和增殖的作用;白花敗醬草總皂苷和水提物誘導 Hela細胞凋亡的同時，各誘導組細胞中Caspase-3活性也比對照組明顯增高，說明Caspase-3參與白花敗醬草皂苷誘導Hela細胞凋亡的作用，有關白花敗醬草皂苷誘導腫瘤細胞凋亡是否通過線粒體或內質網途徑，尚待進一步研究。

1 沈德鳳，楊 波，李進京.黃花敗醬總皂苷提取物抗腫瘤作用的實驗研究〔J〕.黑龍江醫藥科學，2007;30(3):35-6.

2 陳 磊，張 濤，田黎明，等.白花敗醬草提取物對小鼠U14宮頸癌細胞的抑制作用〔J〕.中國老年學雜志，2010;30(8):1091-3.

3 徐潔昕，周方欽，江放明.白花敗醬總皂甙提取工藝研究〔J〕.山東中醫藥大學學報，2005;29(3):227-9.

4 Siu FM，Ma DL，Cheung YW，et al.Proteomic and transcriptomic study on the action of a cytotoxic saponin(Polyphyllin D):induction of endoplasmic reticulum stress and mitochondria-mediated apoptotic pathways〔J〕.Proteomics，2008;8(15):3105-17.

5 Ma DD，Lu HX，Xu LS，et al.Polyphyllin D exerts potent anti--tumour effects on lewis cancer cells under hypoxic conditions〔J〕.JInt Med Res，2009;37(3):631-40.

6 Kaufmann SH，Earnshaw WC.Induction of apoptosis by cancer chemotherapy〔J〕.Exp Cell Research，2000;256(1):42-9.

7 Soto Cerrato V，Llagostera E，Montaner B，et al.Mitochondria-mediated apoptosis operating irrespective of muthidrug resistance in breast cancer cells by the anticancer agent prodigiosin〔J〕.Biochemical Pharmacol，2004;68(7):1345-52.

8 Way TD，Kao MC，Lin JK.Degradation of HER2/neu by apigenin induces apoptosis through cytochrome c release and caspase-3 activation in HER2/neu-overexpressing breast cancer cells〔J〕.FEBSLett，2005;579(1):145-52.?