大黃素對重癥急性胰腺炎大鼠腸黏膜屏障的分子保護機制

王 林 余亮科 王 原 曹克勇 李 靚

(河北聯合大學附屬醫院，河北 唐山 063000)

目前認為重癥急性胰腺炎(SAP)胰腺微循環障礙會導致胰腺腺泡的急性損害和胰腺的急性炎癥〔1〕。臨床上，除有局部病變所特有的表現外，常伴有明顯的全身性炎癥反應綜合征(SIRS)，甚至導致多器官功能衰竭(MOF)，病死率達30% ～50%。如何阻止SAP病情迅速發展，是臨床與基礎研究一直探索而尚未有效解決的一個難題。本實驗觀察大黃素抑制胰蛋白酶、降低血漿致炎因子水平等作用，從而闡明大黃素對腸黏膜機械屏障的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠90只，體重300～350 g，由河北聯合大學實驗動物部提供;牛磺膽酸鈉購自Sigma公司，用生理鹽水配制成5%的溶液;微泵注射器(德國BM公司);白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-8 、IL-10 同位素檢測試劑盒，購自中國人民解放軍總醫院放射免疫研究所，批號200910;臺式高速離心機5415C型(德國Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠SAP模型的建立 參照文獻〔2，3〕介紹的方法。動物麻醉后按無菌操作對大鼠剖腹，于十二指腸內側找到片狀分布的胰腺，并在肝門處用無損傷顯微血管夾夾閉膽胰管，在手術顯微鏡下用微泵注射器對胰管進行穿刺并注射5%牛磺膽酸鈉0.4 ml/kg，壓力高于胰管壓，約10～15 min胰腺出現肉眼可見的水腫出血，表明SAP模型制作成功，松開血管夾，縫合關閉腹腔并開始計時。所有大鼠術后均自由飲水飲食。

1.2.2 實驗分組與處理 將70只SD大鼠隨機分為三組:對照組(假手術組)10只;SAP未治療組(觀察組)30只;SAP大黃素治療組(治療組)30只;觀察組及治療組再分為3個時刻點(12、24、48 h)亞組，各組10只。制模和麻醉成功后，觀察組和治療組用6-0線結扎總膽胰管近肝門末端，以0.75 mm靜脈留置針在十二指腸端向膽胰管內進針5 mm，6-0線結扎，拔除針芯。接輸液泵向膽胰管內以0.2 ml/min速度恒壓逆行注射5%牛磺膽酸鈉溶液(1 ml/kg)，8 min后拆除膽胰管兩端的縫線，拔除穿刺針，8-0線縫扎穿刺孔。假手術組僅開腹翻動十二指腸后縫合腹壁。造模后各組經胃造瘺置管至空腸上段，8-0縫線固定于胃壁并將造瘺管另一端置于體外，逐層關腹并固定。大腿根部皮下注射0.9%氯化鈉溶液20 ml/kg體質量以補充術中失液。在大鼠蘇醒并恢復活動后，治療組通過造瘺管向空腸內注入大黃素溶液(5 mg/ml，5 ml/kg)。模型組和對照組注入等量生理鹽水。三組大鼠門靜脈取血備測血清淀粉酶活性、血漿致炎因子含量。

1.2.3 檢測項目與方法

1.2.3.1 血清淀粉酶 采用AR-CHITECTC8000型全自動生化分析儀檢測，嚴格按試劑盒說明書操作(上海申索佑福醫學診斷用品有限公司)，用酶法測定血清淀粉酶活性。

1.2.3.2 血清致炎因子IL-1β、TNF-α、IL-8、IL-10 均采用雙抗體夾心ELISA法檢測。

1.3 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件進行分析，實驗數據以x±s表示，組內兩兩比較采用配對t檢驗，組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 各組各時間點血淀粉酶水平比較 見表1。

表1 各組各時間點血漿淀粉酶水平(U/L，x ± s，n=10)

2.2 大黃素對SAP大鼠IL-1β、TNF-α、IL-8和IL-10含量的影響 觀察組IL-1β、TNF-α、IL-8較對照組高，且隨時間而加重，說明胰腺被膜下注射5%牛磺膽酸鈉造成大鼠SAP時可以影響血漿內細胞因子水平;在各時間點，治療組 IL-1β、TNF-α、IL-8較觀察組明顯下降(P ＜0.05);在12、24、48 h，治療組IL-10較SAP模型組明顯下降(P＜0.05)，說明大黃素通過調節血漿內細胞因子水平達到治療SAP的作用。見表2～表5。

表2 各組大鼠不同時段血漿IL-1β水平比較(x ± s，n=10)

表3 各組大鼠不同時段血漿TNF-α水平比較(x ± s，n=10)

表4 各組大鼠不同時段血漿IL-8水平比較(x ± s，n=10)

表5 各組大鼠不同時段血漿IL-10水平比較(x ± s，n=10)

3 討論

目前研究認為SAP高致死率的主要原因為腸黏膜屏障高通透性使腸道細菌和內毒素易位，導致SAP繼發胰周及全身感染〔4〕。研究表明炎癥介質在SAP發生、發展過程中起主要作用〔5〕。胰腺炎時胰腺局部微血管痙攣，全身缺血和血壓下降導致灌注不足，胰腺局部微血管痙攣導致微循環障礙，出現胰腺缺血和再灌注損傷，白細胞粘附和嵌頓于血管壁，此過程又導致白細胞過度激活，大量炎癥介質被釋放入血，形成促炎因子激活的級聯放大的復雜網絡互相影響互相促進，進一步導致和加重微循環障礙，加重胰腺損傷，并引發SIRS和MODS，因此，炎癥介質在SAP中起著主要作用。動物實驗研究發現，大鼠SAP時，腸組織微循環血流量明顯減少，血清IL-1β活性較對照組明顯升高。TNF-α是SAP時升高最早的炎癥介質，能直接損傷腸上皮細胞間的緊密連接，還可加速谷氨酰胺消耗，阻止其向α-酮戊二酸轉化，降低腸黏膜細胞三磷酸腺苷水平，加重腸黏膜機械屏障損傷，造成細菌移位;又可誘導IL-1β、IL-6、IL-8以及自身基因表達，從而產生炎癥介質的級聯放大作用，導致血管通透性增加、微循環障礙、細胞功能受損、毛細血管微血栓形成、氧自由基的產生、炎癥反應加劇等不良作用出現。同樣，IL-8可刺激炎癥，激化炎癥細胞對炎癥介質的作用，并能協同TNF-α作用于微血管系統，加重微血栓形成和組織損傷。研究發現，大黃素能有效抑制干擾素-γ+內毒素(LPS)誘導的人結腸癌細胞株HT-29分泌IL-8及核轉錄因子(NF-κB)的活化，具有抗炎作用〔6〕。本實驗證實，SAP時大量活性物質和炎癥介質被釋放入血，導致一系列血液炎性因子的變化，且變化的程度與胰腺損傷的嚴重程度以及與疾病的預后均有密切關系。既往研究認為，大黃可增加胃腸黏膜灌注量，降低腸黏膜及腸毛細血管通透性，清除氧自由基，促進胃腸黏膜新陳代謝，促進腸黏膜內杯狀細胞增生，抑制腸道內細菌過度繁殖和腸道LPS吸收，改善線粒體的呼吸功能，活血化瘀、改善微循環〔7〕。實驗和臨床研究均證實，傳統中藥大黃對腸屏障損傷的保護作用明確，其作用機制是多方面的。本研究發現大黃的主要成分大黃素明顯降低了治療組大鼠TNF-α和IL-8水平，有效地減輕了胰腺的損害，降低了大鼠的病死率，延長了生存時間，用藥期間沒有發現大鼠更多不良反應的出現，這也說明該藥物具有安全性，也為臨床使用奠定了一定理論基礎。

1 張肇達.急性胰腺炎〔M〕.北京:人民衛生出版社，2004:46-70.

2 張群華，蔡 端，吳樹強，等.急性壞死性胰腺炎大鼠的炎性介質變化和生長抑素的作用〔J〕.中華醫學雜志，1997;77(5):355-8.

3 Banerjee AK，Galloway SW，Kingsnorth AN.Experimental models of acute pancreatitis〔J〕.Br J Surg，1994;81(8):1096-103.

4 汪 潔，馬保金，吳 鋼，等.急性壞死性胰腺炎大鼠腸道黏膜屏障功能的損害及腸道細菌移位〔J〕.中華實驗外科雜志，2007;24(5):570-2.

5 Uhl W，Buchler MW，Malfertheiner P，et al.A randomised，double blind，multicentre trial of octreotide in moderate to severe acute pancreatitis〔J〕.Gut，1999;45(1):97-104.

6 劉瑞林，張 嘉，吳 薇，等.大黃素對腸缺血/再灌注損害保護作用的實驗研究〔J〕.中國中西醫結合急救雜志，2008;15(1):45-7.

7 陳德昌，姜興祿，李紅江，等.大黃對危重癥患者胃腸黏膜血流灌注的影響〔J〕.中國急教醫學，1999;19(10):581-4.