反義miRNA-21/rAV-Tumstatin腺病毒載體對(duì)膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

溫都蘇 劉祿成 魏 巍 李 志 郭 航 張 明

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，吉林 長(zhǎng)春 130041)

癌基因與抑癌基因的平衡紊亂在腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中扮演著重要角色〔1，2〕。微小 RNA-21(miRNA-21)是目前公認(rèn)的癌基因〔3，4〕，腫瘤抑素(Tumstatin)則是被廣泛認(rèn)同的抑癌基因〔5〕。已有研究證實(shí)，前者在膀胱癌病人的腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，后者則表達(dá)不足。由此推測(cè)，這兩種基因的平衡失調(diào)在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中可能起著至關(guān)重要的作用。本研究應(yīng)用反義miRNA-21/rAV-Tumstatin腺病毒載體，通過經(jīng)尿道膀胱灌注的方法治療，觀察該載體對(duì)裸鼠膀胱原位移植癌生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 反義miRNA-21/rAV-Tumstatin腺病毒載體由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建〔6，7〕。人膀胱癌T24細(xì)胞株購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。二苯基溴化四氮唑藍(lán)(MTT)比色儀為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。原位末端標(biāo)記(TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自北京中山生物公司。BALB/C裸鼠購于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。

1.2 方法

1.2.1 裸鼠膀胱癌模型的建立和療效評(píng)估及腫瘤標(biāo)本的處理按照參考文獻(xiàn)〔6〕所述方法建立模型。選取20只瘤體大小幾乎相同的成瘤裸鼠，隨機(jī)分為四組，每組5只，分別每隔5 d經(jīng)尿道膀胱灌注1次載體(反義miRNA-21、rAV-Tumstatin、聯(lián)合應(yīng)用組)和生理鹽水(對(duì)照組)，每組均灌注4次，28 d為1個(gè)療程。每隔7 d(灌注后的第2天)用ESDREF1.5T核磁掃描儀檢測(cè)腫瘤大小，計(jì)算腫瘤體積。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的第2天處死所有裸鼠，迅速切開膀胱，完整剝?nèi)×鲶w稱重，并用游標(biāo)卡尺檢測(cè)腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑，以長(zhǎng)(mm)×寬(mm)表示腫瘤的大小，然后切片，10%甲醛固定，石蠟包埋備用。

1.2.2 MTT法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖 5μm厚的組織切片脫蠟、脫水后經(jīng)蛋白酶 K 37℃消化30 min，雙氧水封閉，滴加MMT顯色液，37℃濕盒孵育1 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次后加過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，37℃濕盒孵育30min，蘇木素復(fù)染。用PBS代替MTT顯色液作為陰性對(duì)照，陽性對(duì)照切片經(jīng)DNA酶Ⅱ預(yù)處理10 min后按MTT法步驟進(jìn)行染色，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。陽性結(jié)果判定:增殖細(xì)胞的胞質(zhì)呈黃褐色。每張切片觀察5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，增殖細(xì)胞所占的百分率即為瘤細(xì)胞的增殖率。

1.2.3 TUNEL法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡 仍用1.2.2的處理標(biāo)本，不同的是，把滴加的MTT顯色液換為TUNEL反應(yīng)液進(jìn)行孵育，以PBS代替TUNEL作為陰性對(duì)照。陽性對(duì)照切片經(jīng)DNA酶Ⅰ處理后按TUNEL法染色步驟。結(jié)果判定:凋亡細(xì)胞的胞核呈棕黃色，凋亡細(xì)胞在計(jì)數(shù)的200個(gè)細(xì)胞中所占的百分率即為凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，資料數(shù)據(jù)以x±s表示，均數(shù)間比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 反義miRNA-21/rAV-Tumstatin雙靶向治療對(duì)移植瘤生長(zhǎng)的影響 反義miRNA-21組，rAV-Tumstatin組和聯(lián)合應(yīng)用組的腫瘤體積分別從第14、21、28天開始逐漸變小，三個(gè)治療組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，其中聯(lián)合應(yīng)用組的抑瘤效果最為顯著，從第28天起該組裸鼠的腫瘤體積明顯小于rAV-Tumstatin組(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后測(cè)得各組的腫瘤大小依次是:反義 miRNA-21組(37.50±9.21)mm2，rAV-Tumstatin組(28.64±5.13)mm2，聯(lián)合用藥組(13.78±6.25)mm2，對(duì)照組(69.75±8.43)mm2。單一治療組與對(duì)照組比較雖差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但聯(lián)合用藥組和對(duì)照組比較差異更明顯(P＜0.01)。

2.2 反義miRNA-21/rAV-Tumstatin雙靶向治療對(duì)移植瘤組織中腫瘤細(xì)胞增殖的影響 反義miRNA-21組，rAV-Tumstatin組，聯(lián)合應(yīng)用組和對(duì)照組的細(xì)胞增殖率分別為48.7%±6.2%，35.8% ±9.4%，27.8% ±3.7%和92.8% ±7.4%。與對(duì)照組比較，各治療組細(xì)胞均出現(xiàn)了不同程度的生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象(均P＜0.01)，其中聯(lián)合應(yīng)用組的生長(zhǎng)抑制最為明顯，與rAV-Tumstatin組比較，差異仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖1。

2.3 反義miRNA-21/rAV-Tumstatin雙靶向治療對(duì)移植瘤組織中腫瘤細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示，反義miRNA-21組，rAV-Tumstatin組，聯(lián)合應(yīng)用組和對(duì)照組腫瘤細(xì)胞的凋亡率分別為51.2% ±7.5%，57.8% ±6.9%，79.3% ±4.1%和8.3%±2.6%。三個(gè)治療組的凋亡率均比對(duì)照組明顯增加(均P＜0.01)，其中聯(lián)合應(yīng)用組細(xì)胞的凋亡率最高，與單一治療的兩組比較，差異仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖2。

圖1 裸鼠移植瘤細(xì)胞增殖分析(MTT，×200)

圖2 裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡分析(TUNEL，×200)

3 討論

新近研究認(rèn)為，腫瘤是一個(gè)多因素和多基因共同參與的復(fù)雜疾病。由于聯(lián)合基因靶向治療腫瘤可針對(duì)不同的基因極大地提高腫瘤相關(guān)基因的治療效果，同時(shí)降低對(duì)其他正常組織器官的毒副作用，故成為目前腫瘤治療研究的熱點(diǎn)〔8，9〕。本實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)癌基因miRNA-21和抑癌基因Tumstatin分別構(gòu)建了反義miRNA-21和rAV-Tumstatin腺病毒載體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)裸鼠原位膀胱癌移植模型及癌細(xì)胞雖然均具有抑制增殖并誘導(dǎo)其凋亡的作用，但是聯(lián)合應(yīng)用時(shí)作用更大，效果更佳。這一結(jié)果提示:靶向miRNA-21和Tumstatin均可分別抑制膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，但靶向雙位點(diǎn)由于在抑制癌基因表達(dá)的同時(shí)上調(diào)了抑癌基因水平，從兩個(gè)截然不同的層面雙重作用，具有更好的正性相加功效，從而使其抑制腫瘤的作用發(fā)揮到最大程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為臨床膀胱癌的多位點(diǎn)基因治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，亦為今后的臨床試驗(yàn)奠定了理論基礎(chǔ)，其臨床實(shí)際應(yīng)用前景與潛力值得進(jìn)一步深入研究。

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