逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)系統(tǒng)感染原代培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞

張清華 艾 民 蔣知新 沙 杭 高 毅 盧 海

(中國(guó)人民解放軍三零五醫(yī)院，北京 100017)

胚胎干細(xì)胞(ESCs)是具有無(wú)限增殖，自我更新和多向分化潛能的一種未分化細(xì)胞，在體外可被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞〔1〕、平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞〔2〕、造血細(xì)胞〔3〕而用于多種疾病的治療，具有廣闊的研究和臨床應(yīng)用前景。目前，ESCs研究也存在著一些問(wèn)題，如免疫排斥反應(yīng)和倫理學(xué)問(wèn)題的爭(zhēng)論。誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞技術(shù)是將多能性基因轉(zhuǎn)染到已分化的體細(xì)胞，將其重編程為類(lèi)似于ESCs的多潛能干細(xì)胞，并被命名為“誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞”(iPSCs)，簡(jiǎn)稱(chēng)“iPS細(xì)胞”〔4〕。iPS細(xì)胞回避了 ESCs免疫排斥反應(yīng)和倫理學(xué)的爭(zhēng)論問(wèn)題，近年來(lái)成為干細(xì)胞領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)擬采用包裝生產(chǎn)攜帶綠色熒光蛋白(GFP)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染原代培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞(HSF)，判斷逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)HSF細(xì)胞的感染情況，為下一步HSF細(xì)胞重編程實(shí)驗(yàn)提供技術(shù)保證。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑 皮膚標(biāo)本來(lái)源于南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院，經(jīng)患者及其家屬同意簽字后方可取標(biāo)本。高糖型DMEM、10%FBS、PBS、明膠、pMX-GFP、pCL 包裝質(zhì)粒、polybrene、磷酸鈣轉(zhuǎn)染用試劑盒。

1.2 原代培養(yǎng)HSF細(xì)胞〔5〕手術(shù)取患者上臂內(nèi)側(cè)至真皮層2 cm×2 cm皮膚組織標(biāo)本，用PBS將組織標(biāo)本清洗3遍后剪碎至1 mm×2 mm左右，將其平鋪到包被明膠的培養(yǎng)皿中，添加HSF細(xì)胞培養(yǎng)基(高糖型DMEM+10%FBS)，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天更換HSF細(xì)胞培養(yǎng)基。

1.3 包裝生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒 采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將GFP基因轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞內(nèi)，具體步驟如下:先加水，再加pMX-GFP和pCL包裝質(zhì)粒混勻。向混合液中加入2 mol/L CaCl2顛倒混勻。再向混合液中加入2×HBS反復(fù)吸吹混勻。在室溫下靜置2 min，加入等體積的293T細(xì)胞培養(yǎng)基(高糖型DMEM+10%FBS)，將鈣轉(zhuǎn)液逐滴均勻滴加到293T細(xì)胞中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，12～16 h后更換培養(yǎng)液，36～48 h收集病毒上清液。

1.4 收集病毒感染HSF細(xì)胞 應(yīng)用巴氏吸管收集病毒上清液，經(jīng)0.45μm濾過(guò)膜過(guò)濾到15 ml離心試管中，加入終濃度為8 ng/ml polybrene混勻，感染前更換新的HSF細(xì)胞培養(yǎng)基，將收集過(guò)濾的病毒上清液感染HSF細(xì)胞。

1.5 HSF細(xì)胞觀察 顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)HSF細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程和包裝生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染HSF細(xì)胞情況，并拍照。

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)HSF細(xì)胞 人皮膚組織塊接種1 w左右，可見(jiàn)少量的HSF細(xì)胞從組織塊周?chē)莱觯书L(zhǎng)梭形、不規(guī)則形。2 w左右組織塊周?chē)鶫SF細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，部分細(xì)胞生長(zhǎng)密度超過(guò)90%，呈放射狀、柵欄狀或漩渦狀排列。見(jiàn)圖1。

2.2 包裝生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒 利用磷酸鈣法將pMX-GFP和pCL包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞，48 h后熒光顯微鏡下觀察，293T細(xì)胞正在包裝生產(chǎn)攜帶GFP基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒。見(jiàn)圖2。

2.3 病毒感染HSF細(xì)胞 收集病毒上清液感染HSF細(xì)胞，48 h后倒置熒光顯微鏡下觀察，包裝生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染絕大多數(shù)HSF細(xì)胞，被病毒感染的HSF細(xì)胞能夠穩(wěn)定表達(dá)外源性GFP基因。見(jiàn)圖3。

圖1 原代培養(yǎng)HSF細(xì)胞(×100)

圖2 293T細(xì)胞(×100)

圖3 病毒感染HSF細(xì)胞(×100)

3 討論

HSF細(xì)胞位于人皮膚真皮層中，細(xì)胞來(lái)源廣泛充足，取材容易方便，而HSF細(xì)胞來(lái)源的iPS細(xì)胞在干細(xì)胞領(lǐng)域具有廣闊的研究空間和應(yīng)用前景，故本實(shí)驗(yàn)選擇HSF細(xì)胞作為逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的候選細(xì)胞。采用組織塊貼壁法在體外分離培養(yǎng)出HSF細(xì)胞，鏡下觀察HSF細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程。一些組織塊周?chē)紫瘸霈F(xiàn)角質(zhì)細(xì)胞，呈薄膜狀，而另一些組織塊周?chē)猩倭恐炯?xì)胞出現(xiàn)，可能切除皮膚組織標(biāo)本過(guò)厚(至脂肪層)引起。1 w左右部分組織塊周?chē)莱錾倭縃SF細(xì)胞，隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)HSF細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，形態(tài)呈長(zhǎng)梭形、不規(guī)則形。2 w左右HSF細(xì)胞生長(zhǎng)密度超過(guò)90%，排列呈放射狀、柵欄狀或漩渦狀，此時(shí)可進(jìn)行HSF細(xì)胞傳代培養(yǎng)和凍存。組織塊貼壁法分離培養(yǎng)HSF細(xì)胞時(shí)間周期相對(duì)較長(zhǎng)，因此在培養(yǎng)的過(guò)程中要注意防止細(xì)胞污染。HSF細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為3～6 d，此時(shí)HSF細(xì)胞生長(zhǎng)未受抑制、活力最佳，為逆轉(zhuǎn)錄病毒感染HSF細(xì)胞最佳研究階段。

目前，可利用逆轉(zhuǎn)錄病毒〔4〕、慢病毒〔6〕、腺病毒〔7〕或轉(zhuǎn)座子〔8〕等介導(dǎo)方式，將外源性目的基因?qū)塍w細(xì)胞內(nèi)將其重編程為iPS細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)利用逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體將GFP基因?qū)際SF細(xì)胞，評(píng)價(jià)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染HSF細(xì)胞及被導(dǎo)入外源性基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。逆轉(zhuǎn)錄病毒為攜帶逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA病毒，可與多種細(xì)胞表面蛋白相結(jié)合而進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，然后以病毒RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)一步整合到宿主細(xì)胞染色體內(nèi)，隨宿主細(xì)胞DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體感染體細(xì)胞具有感染細(xì)胞范圍廣、病毒滴定度高、攜帶外源性基因容量大、整合到細(xì)胞DNA中能夠使外源性基因在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)。首先，應(yīng)用磷酸鈣法將pMX-GFP和pCL包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞后，倒置熒光顯微鏡對(duì)比明、暗視野下不帶綠色熒光和帶綠色熒光293T細(xì)胞。結(jié)果顯示，逆轉(zhuǎn)錄病毒成功的感染293T細(xì)胞，表明攜帶GFP基因已轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞內(nèi)，293T細(xì)胞成功包裝生產(chǎn)攜帶GFP基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒。在pMX-GFP和pCL包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h后，收集病毒上清液感染原代培養(yǎng)HSF細(xì)胞，48 h后在倒置熒光顯微鏡下對(duì)比帶綠色熒光(暗視野)和不帶綠色熒光(明視野)HSF細(xì)胞。結(jié)果顯示大多數(shù)HSF細(xì)胞被包裝生產(chǎn)后的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，逆轉(zhuǎn)錄病毒將外源性GFP基因成功的轉(zhuǎn)染到HSF細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞能夠穩(wěn)定的表達(dá)外源性GFP基因。上述實(shí)驗(yàn)表明逆轉(zhuǎn)錄病毒可作為有效的基因轉(zhuǎn)移載體，將外源性基因轉(zhuǎn)移到HSF細(xì)胞內(nèi)，為下一步將其重編程為iPS細(xì)胞提供技術(shù)保障。

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