苦馬豆素對(duì)家兔肝臟抗氧化功能的影響

王帥 張玲 陳根元 馬春暉

苦馬豆素(Swainsonine，簡(jiǎn)寫(xiě)為SW)是豆科棘豆屬(Oxytropis)和黃芪屬(Astragalus)等瘋草植物的主要有毒成分［1］。瘋草在我國(guó)分布極為廣泛，嚴(yán)重影響著我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展［2］。目前國(guó)內(nèi)外研究認(rèn)為SW引起家畜中毒的機(jī)理主要為SW是α－甘露糖苷酶的特異性抑制劑，可導(dǎo)致合成的低聚糖在溶酶體內(nèi)蓄積，從而影響糖蛋白的合成，其特征性病理變化為組織細(xì)胞的胞漿空泡變性［3］。根據(jù)楊鳴琦等［4］的研究，盡管SW能引起肝、腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞空泡變性，但低聚糖僅蓄積于腎臟，說(shuō)明SW可通過(guò)其它途徑導(dǎo)致肝臟細(xì)胞發(fā)生空泡變性。李培峰等［5］認(rèn)為生物堿中毒導(dǎo)致的細(xì)胞空泡變性與自由基引起的空泡變性有一定的相似性，并初步研究了臭豆堿和黃花堿對(duì)小鼠氧自由基(·O2)代謝的影響，發(fā)現(xiàn)這兩種生物堿會(huì)降低小鼠機(jī)體的超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH－Px)的活性。肝臟是機(jī)體重要的抗氧化系統(tǒng)，目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)SW對(duì)動(dòng)物肝臟抗氧化功能影響的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定SW對(duì)家兔肝臟抗氧化物酶和過(guò)氧化物的影響，分析SW對(duì)家兔肝臟自由基代謝的影響，進(jìn)一步探討動(dòng)物小花棘豆中毒的機(jī)理，為合理制定家畜小花棘豆中毒防治方法提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料、試劑與儀器

小花棘豆2011年8月采集于新疆阿拉爾市托喀依鄉(xiāng)，由塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院草業(yè)科學(xué)學(xué)科組鑒定。取植株的地上部分，陰干、保存?zhèn)溆谩?/p>

超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH －Px)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、游離脂肪酸(NEFA)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、羥自由基(·OH)檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物技術(shù)有限公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純;實(shí)驗(yàn)室用水為超純水。

Carry 100型紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)，澳大利亞;BS124型精密電子天平，德國(guó)賽多力斯;Direct－Q3型超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore;MR231型高速冷凍離心機(jī)，法國(guó)Jouan。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

家兔24只，雌雄各半，體重(2.0±0.1 kg)，購(gòu)自塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)站。隨機(jī)分為對(duì)照組，試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組，每組6只。分籠飼養(yǎng)，自由采食和飲水。對(duì)照組飼喂全價(jià)飼料，試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組分別飼喂含有小花棘豆15%、30%和45%的混合日糧。

1.3 動(dòng)物飼料

將小花棘豆全草粉碎，過(guò)200目篩，按15%、30%、45%的比例與全價(jià)飼料充分混合。根據(jù)氣相色譜法測(cè)定結(jié)果［6］，相當(dāng)于SW添加量為30 mg/kg、60 mg/kg和 90 mg/kg。全價(jià)飼料組成為:面粉25%，玉米粉24%，豆餅20%，麩皮10%，魚(yú)粉5%，植物油1%，酵母粉1%，食鹽1%，魚(yú)肝油1%，骨粉1%，礦物質(zhì)添加劑 0.9%。維生素添加劑0.1%［7］。利用顆粒飼料機(jī)將其制成顆粒料，干燥后備用。

1.4 臨床癥狀觀察

每天觀察并記錄各試驗(yàn)組家兔的飲食狀況、精神狀態(tài)、行為活動(dòng)及臨床癥狀等變化，記錄家兔的采食量，每周定期測(cè)量各試驗(yàn)家兔的體質(zhì)量，直到出現(xiàn)典型中毒癥狀為止。

1.5 肝臟組織抗氧化指標(biāo)的測(cè)定

在攻毒后14、35和70 d每組隨機(jī)取2只家兔，剖殺后取肝臟于冰生理鹽水中。制成10%組織勻漿，3 000 r/min離心10 min后取上清液用于SOD、GSH－Px、CAT和 NOS活性的測(cè)定，MDA、NEFA、NO和·OH含量的測(cè)定。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)分析用SPSS 11.5中One－Way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 家兔臨床癥狀、采食量及體質(zhì)量的變化

對(duì)照組家兔整個(gè)試驗(yàn)期未見(jiàn)異常。攻毒后第1周開(kāi)始各試驗(yàn)組家兔被毛開(kāi)始失去光澤;第3周出現(xiàn)被毛豎立，其中試驗(yàn)Ⅲ組最為明顯;第10周時(shí)試驗(yàn)Ⅲ組出現(xiàn)典型中毒癥狀，表現(xiàn)為躁動(dòng)不安，頭部和四肢出現(xiàn)神經(jīng)性震顫，對(duì)外界反應(yīng)遲鈍，運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性下降，其臨床癥狀與沈明華等［8］的報(bào)道一致。

在試驗(yàn)期間，對(duì)照組家兔平均采食量基本無(wú)變化。各試驗(yàn)組攻毒后1周內(nèi)采食量略有升高，但試驗(yàn)Ⅲ組從第2周開(kāi)始采食量下降，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組采食量從第3周開(kāi)始下降。這可能與動(dòng)物采食小花棘豆初期會(huì)產(chǎn)生成癮性有關(guān)。整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)試驗(yàn)組家兔體重呈現(xiàn)先增長(zhǎng)，后下降的趨勢(shì)，其中試驗(yàn)Ⅲ組下降幅度最大。

2.2 家兔肝臟SOD、GSH－Px和CAT活性的變化

圖1 家兔試驗(yàn)期內(nèi)采食量(A)和體質(zhì)量(B)的變化

在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)對(duì)照組家兔肝臟SOD、GSHPx和CAT活性均無(wú)明顯變化，試驗(yàn)組家兔SOD、GSH－Px和CAT活性均顯著下降。攻毒第14 d時(shí)試驗(yàn)Ⅲ組家兔肝臟SOD活性極顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組家兔SOD活性顯著低于對(duì)照組(P＜0.05);攻毒第35 d時(shí)所有試驗(yàn)組家兔SOD活性極顯著低于對(duì)照(P＜0.01)。攻毒第14 d時(shí)，所有試驗(yàn)組家兔肝臟GSH－Px活性均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，攻毒第35 d時(shí)所有試驗(yàn)組家兔GSH－Px活性極顯著低于對(duì)照(P＜0.01)。與正常對(duì)照組相比，在攻毒第14 d時(shí)，所有試驗(yàn)組家兔CAT活性均已極顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)。說(shuō)明SW可顯著影響家兔肝臟抗氧化物酶的活性，而且隨著攻毒劑量的增加，家兔酶活性的下降就越明顯，即SW可通過(guò)影響肝臟抗氧化物酶的活性而干擾家兔體內(nèi)自由基的代謝。

圖2 家兔試驗(yàn)期內(nèi)SOD(A)、GSH－Px(B)和CAT(C)活性的變化

2.3 家兔肝臟MDA含量的變化

由圖3可知，在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)對(duì)照組家兔肝臟中MDA含量無(wú)明顯變化。在攻毒第14 d時(shí)，所有試驗(yàn)組家兔MDA含量均已極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，隨著攻毒劑量的增加，小鼠體內(nèi)MDA的蓄積也就越多。說(shuō)明SW可顯著影響家兔肝臟MDA的代謝。

圖3 家兔試驗(yàn)期內(nèi)MDA含量的變化

2.4 家兔肝臟·OH含量的變化

由圖4可知，在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)對(duì)照組家兔·OH含量無(wú)明顯變化，而試驗(yàn)組家兔·OH含量均異常升高。在攻毒第14 d時(shí)，試驗(yàn)Ⅲ組和試驗(yàn)Ⅱ組家兔肝臟·OH含量均極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，試驗(yàn)Ⅰ組家兔·OH含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);攻毒第35 d時(shí)所有試驗(yàn)家兔·OH含量均極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。說(shuō)明SW會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體·OH蓄積，引起機(jī)體損傷。

2.5 家兔肝臟NEFA含量的變化

由圖5可知，整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)試驗(yàn)組家兔肝臟NEFA含量均有不同程度的增加，并與日糧中SW含量呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間－劑量效應(yīng)關(guān)系。攻毒第14 d時(shí)，試驗(yàn)Ⅲ組家兔NEFA含量極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，試驗(yàn)Ⅱ組家兔NEFA含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，試驗(yàn)Ⅰ組家兔NEFA含量與對(duì)照組差異不顯著(P﹥0.05);攻毒第35 d時(shí)，試驗(yàn)Ⅰ組家兔NEFA含量與對(duì)照組差異顯著(P＜0.05)，試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組家兔NEFA含量與對(duì)照組差異極顯著(P＜0.01);攻毒第70 d時(shí)所有試驗(yàn)組家兔肝臟NEFA含量極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。

圖4 家兔試驗(yàn)期內(nèi)·OH含量的變化

2.6 家兔肝臟NO和NOS的變化

圖5 家兔試驗(yàn)期內(nèi)NEFA含量的變化

由圖6可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組NO和NOS含量均有不同程度的升高。攻毒第14 d時(shí)，試驗(yàn)Ⅲ組家兔NO和NOS含量均極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01);試驗(yàn)Ⅱ組家兔NO含量極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，NOS含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);試驗(yàn)Ⅰ組家兔NO和NOS含量均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。攻毒第35 d時(shí)，試驗(yàn)組家兔NOS和NO含量與對(duì)照組差異均極顯著(P＜0.01)，試驗(yàn)組NO和NOS含量的變化趨勢(shì)均一致。

圖6 家兔試驗(yàn)期內(nèi)NO(A)和NOS(B)含量的變化

3 討論

SOD、GSH－Px和CAT均為生物體內(nèi)重要的抗氧化物酶，SOD在生物體內(nèi)將超氧自由基轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫，GSH－Px和CAT可立即將過(guò)氧化氫分解為無(wú)害的水，這樣3種酶即組成了一個(gè)完整的抗氧化體系，起到了保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用［9］。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，SW可顯著降低家兔肝臟中SOD、GSH－Px和CAT的生物合成或活化，嚴(yán)重影響了機(jī)體的抗氧化能力，從而影響了血清和組織中自由基及其中間產(chǎn)物過(guò)氧化氫的分解，造成了細(xì)胞膜多不飽和脂肪酸的過(guò)氧化，加劇了細(xì)胞的脅迫損傷。

機(jī)體產(chǎn)生的自由基約有95%為·O2，·O2可與組織生物膜的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化連鎖反應(yīng)，產(chǎn)生大量MDA，即MDA含量的變化可反應(yīng)·O2的代謝情況［10］。本試驗(yàn)中家兔攻毒后肝臟中的MDA含量極顯著升高，可能是因?yàn)镾W降低了機(jī)體中抗氧化物酶的活性，從而影響了機(jī)體MDA的清除，導(dǎo)致了MDA大量蓄積于機(jī)體組織細(xì)胞中，造成了機(jī)體組織的毒理性變化。說(shuō)明SW可顯著影響動(dòng)物機(jī)體·O2的代謝。

·OH是氧化性最強(qiáng)的自由基，可殺死紅細(xì)胞，降解DNA、細(xì)胞膜和多糖化合物，對(duì)機(jī)體危害極大。機(jī)體中的·OH主要是由過(guò)氧化物負(fù)離子和過(guò)氧化氫反應(yīng)生成的［11］。在本試驗(yàn)中家兔攻毒后機(jī)體·OH含量急劇上升，而且其增加量與SW的攝入量呈正相關(guān)。其原因可能為SW顯著降低了機(jī)體抗氧化物酶的活性，既影響了機(jī)體對(duì)·OH的清除，又影響了自由基代謝產(chǎn)物過(guò)氧化氫的分解，從而導(dǎo)致了·OH的增多，最終導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞和器官的損傷，說(shuō)明SW可顯著影響動(dòng)物機(jī)體·OH的代謝。

NEFA是細(xì)胞膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)和前列腺素合成的供體，也是重要的能源物質(zhì)。同時(shí)，它也是具有高度細(xì)胞毒性的兩性分子［12］。試驗(yàn)結(jié)果表明，攻毒試驗(yàn)各組肝臟NEFA含量與對(duì)照組比較均有不同程度的升高。NEFA不僅對(duì)肝臟細(xì)胞有直接的毒性作用，其中的不飽和脂肪酸還可通過(guò)加強(qiáng)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)損傷肝臟細(xì)胞，致使肝臟功能受損。

NO在動(dòng)物體內(nèi)是由NOS合成的，既是一種重要的營(yíng)養(yǎng)代謝信號(hào)分子，同時(shí)也是一種自由基，高濃度的NO會(huì)氧化細(xì)胞生物膜，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜的損傷以及重要的生化反應(yīng)受到抑制，甚至引起細(xì)胞死亡。NOS是間接研究NO病理生理的作用的重要環(huán)節(jié)，NOS表達(dá)的增加會(huì)持續(xù)產(chǎn)生大量的NO，發(fā)揮細(xì)胞毒性作用及過(guò)氧化反應(yīng)，對(duì)肝臟造成嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致肝臟出血和實(shí)質(zhì)性變化［13］。試驗(yàn)中SW可引起家兔肝臟NO和NOS的持續(xù)升高，說(shuō)明SW可通過(guò)影響NO自由基的代謝從而導(dǎo)致家兔肝臟功能受損。

目前研究表明，外源物質(zhì)一般通過(guò)兩條途徑影響動(dòng)物機(jī)體的自由基代謝，一是直接影響體內(nèi)的自由基含量，二是通過(guò)影響體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，從而影響自由基的代謝［14］。機(jī)體中自由基的清除主要依賴(lài)于酶促自由基清除系統(tǒng)，如SOD、CAT、GSH－Px等。但在病理或機(jī)體中毒的情況下，自由基的產(chǎn)生超過(guò)了清除能力，過(guò)剩的自由基及其代謝的中間產(chǎn)物是許多疾病發(fā)生的根源［13］。從本次的試驗(yàn)可以看出，SW作為一種毒物進(jìn)入家兔機(jī)體后，對(duì)家兔抗氧化酶系及脂質(zhì)氧化代謝終產(chǎn)物含量產(chǎn)生了顯著影響。本研究證明，經(jīng)口服攻毒后，SW使家兔肝臟抗氧化酶的活性極顯著降低(P＜0.01)，過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量極顯著升高(P＜0.01);機(jī)體·O2、·OH和NO等自由基的代謝均受到顯著影響，可能會(huì)導(dǎo)致家兔肝臟功能?chē)?yán)重受損。這與臨床上觀察到的小花棘豆中毒動(dòng)物的癥狀一致［3］。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了肝臟組織易受到自由基的損傷，其病理變化的嚴(yán)重程度與自由基增多有關(guān)。

4 結(jié)論

通過(guò)小花棘豆對(duì)家兔的攻毒試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)小花棘豆主要毒性成分SW可顯著降低家兔機(jī)體SOD、GSH－Px和CAT等抗氧化酶的活性，并導(dǎo)致機(jī)體MDA、NO等過(guò)氧化產(chǎn)物的濃度增加。說(shuō)明SW可顯著影響肝臟自由基的代謝，從而導(dǎo)致肝臟損傷。

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