FQ-PCR技術在小兒結核性腦膜炎診斷中的應用

劉彥軒，賈安奎，郭盛菊，尚好珍

(1新鄉醫學院第一附屬醫院，河南新鄉453100;2河南省結核病醫院)

結核性腦膜炎(簡稱結腦)是小兒時期最常見和最嚴重的肺外結核病之一，病死率高達30% ～50%，幸存者中20% ～50%遺留有永久性神經系統后遺癥(如偏癱、失語、失明等)，早期診斷是決定患兒預后的關鍵因素［1］。目前臨床診斷結腦多依靠實驗室檢查，但常規實驗方法敏感性低、耗時長。陳效友等［2］研究顯示，以Taq酶標記的熒光定量PCR(FQ-PCR)檢測痰和血標本中結核菌(TB)靈敏度高達10fg DNA和1～5個菌體/mL，靈敏度比普通PCR高10～100倍。2009年3月～2011年2月，我們應用FQ-PCR技術對30例結腦患兒腦脊液中TBDNA進行了檢測，并與抗酸桿菌涂片、TB培養、TBAb、腺苷酸脫氨酶(ADA)活性指標進行了比較，旨在為結腦早期診斷提供一個較適宜的實驗室診斷方法。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 同期收治的結腦住院患兒30例(結腦組)，男、女各15例，年齡6個月～12歲(平均5.7 歲)，體質量指數(BMI)為(18.3 ±1.6)kg/m2。均符合胡亞美主編第2002版《實用兒科學》診斷標準，未進行腦脊液檢查的結腦患兒［1］排除。另設我院收治的非TB感染性腦膜炎或腦炎患兒為對照組，男、女各15例，年齡5個月 ～12歲(平均5.5歲)，BMI為(19.1 ±1.7)kg/m2;均根據臨床表現、腦脊液蛋白增加或葡萄糖量降低，一般抗生素治療有效或腦脊液中查到特異性病毒抗體IgM，或培養出一般細菌等診斷［3］，其中病毒性腦膜炎18例、化膿性腦膜炎6例、隱球菌腦膜炎3例、腦膜瘤2例、流行性乙型腦炎1例。兩組年齡、性別等一般資料具有可比性。

1.2 腦脊液中相關指標檢測 ① TB-DNA:采用FQ-PCR法(中山大學達安基因公司產DA7600型擴增儀)。取腦脊液沉淀100μL加入等量濃縮液，振蕩數秒，以12 000 r/min離心10 min，棄上清液后加入50μL DNA提取液，置于100℃恒溫金屬浴10 min。以12 000 r/min離心10 min，取上清液2μL加入毛細管進行PCR反應，每批加有陰、陽性質控品和4個濃度的TB陽性定量參考品，擴增檢測步驟按試劑盒操作說明進行，擴增曲線呈s型，且ct值＜30、TB-DNA含量＞5.0×10拷貝/mL為陽性。②抗酸桿菌涂片、TB培養:腦脊液盲法編號后進行沉渣涂片抗酸染色鏡檢、改良羅氏法培養TB。③TB-Ab 、ADA 活性:應用結明(MyCoDot.TM)結核病快捷診斷試劑盒(美國Dyna-Gen公司)檢測TB-Ab，操作參照說明書進行;采用奧林巴斯 OLYMPUS AU2700全自動生化分析儀及北京利德曼ADA測定試劑盒檢測ADA活性，按說明書操作(正常參考值0～8 U/L)。上述方法檢測陽性標本經抗結核治療3周后復檢。

1.3 統計學方法 采用CS2000統計學軟件進行統計學處理。計量數據以ˉx±s表示，兩樣本均數比較采用t或t'檢驗，兩樣本率比較采用四格表法Pearson χ2或 Yatesχ2檢驗，檢驗水準 α =0.05。

2 結果

2.1 不同指標初檢情況 結腦組TB-DNA檢測陽性率顯著高于抗酸桿菌涂片、TB羅氏培養、TB-Ab(χ2=4.444 4)，但與 ADA 比較無顯著差異(χ2=0.266 7)。對照組 ADA有 6例升高，其特異性(80%)低于其他四種指標(100%)，χ2=4.629 6，見表1。

表1 不同指標初檢結果比較

2.2 初診檢測陽性標本抗結核治療3周后復檢情況 結腦組16例TB-DNA陽性患者及14例ADA活性陽性患者復檢均轉陰;對照組6例ADA活性陽性患者復檢仍為陽性。

3 討論

結腦是肺外結核中最具威脅的疾病，早期病死率不足10%，但晚期可達60%以上，故早期診斷意義重大［4］。腦脊液能直接反映中樞神經系統病理變化，是檢測的理想標本，其中細菌學病原體檢查是實驗診斷結腦的“金標準”，但結腦患兒腦脊液中含菌量太低，加之基層醫療機構不規則治療常致低活力菌和L型菌等細菌生物學性狀發生改變［5］，導致細菌涂片、培養敏感性更低，腦脊液常規生化改變不典型，很容易漏診。本研究顯示，抗酸桿菌涂片陽性率為0、TB培養陽性率為6.7%，與文獻［6］報道基本一致。此外，TB培養時間約5周，無法滿足臨床早期診斷結腦的需要。

FQ-PCR是指在PCR反應體系中加入熒光化學基團，通過熒光定量PCR儀實時、自動監測整個PCR擴增過程中熒光信號的積累，檢測PCR擴增產物及對未知模板進行定量分析的方法，其TaqMan探針對目標序列特異性高，可用于目標基因的檢測和定量，特別適用于單核苷酸多態性(SNP)檢測［7］。此外，FQ-PCR全“封閉”式的操作、dUPT-UNG酶防污染體系的設立，在相當程度上解決了普通PCR難以避免的實驗污染問題;比普通PCR后的電泳檢測靈敏度高2～3個數量級［8］。而傳統涂片抗酸桿菌染色法需每毫升痰標本達5 000～10 000條菌以上才可能檢出陽性結果［9，10］;改良羅氏培養法的靈敏度可達10條/mL，但一般需要6～8周才能報告結果［10］。

本研究顯示，結腦組TB-DNA陽性率明顯低于TB-Ab，但對照組兩者陽性率均為0。提示此兩指標特異性均為100%，但FQ-PCR所測TB-DNA具有更高的敏感性，可降低結腦漏診率。本研究還顯示，結腦組TB-DNA和ADA陽性率相似，但對照組ADA陽性率顯著高于結腦組，且6例ADA陽性病例經抗結核治療后復檢ADA結果仍呈陽性。提示此兩指標均有較好的敏感性，但ADA特異性偏低，可能造成誤診率增加。

綜上所述，FQ-PCR檢測腦脊液中TB-DNA較其他傳統實驗室檢測方法更具特異性和敏感性，且操作簡便、快速，可作為結腦早期輔助診斷、預后觀察和療效評價的有力手段。

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