YLSC對心肌缺血再灌注損傷細胞ASK1、Cyt-C、Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

覃斐章，簡 潔，焦 楊，黃仁彬

(廣西醫科大學藥學院，南寧530021)

17-甲氧基-7-羥基—苯并呋喃查爾酮(YLSC)是從廣西壯族的特色藥材玉郎傘中分離的黃酮類新化合物，其分子式為C18H14O4，相對分子質量為294.3，已授權1項國家發明專利(200710034771.2)。實驗表明，YLSC具有良好的心血管藥理活性(如抗氧化、耐缺氧、抗凝血［1］等)，對體外培養乳鼠心肌細胞的缺氧/復氧具有較好的保護作用，能明顯增加心肌細胞的存活率，其機制與抗氧化、增加細胞膜表面的ATPase活性有關［2］。2011年6月，我們觀察了YLSC對凋亡相關蛋白如凋亡信號調節蛋白1(Apoptosis signal regulating kinase 1，ASK1)、細胞色素 C(Cytochrome c，Cyt-C)、Bcl-2、Bax 蛋白表達的影響，旨在進一步研究其對缺血再灌注誘導凋亡的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 ①動物:SPF級SD大鼠，雄性，體質量200～250 g，由廣西醫科大學試驗動物中心提供。②藥物與試劑:YLSC，廣西醫科大學藥理教研室提供，高效液相色譜法(HPLC)檢測純度為98%，用0.5%的二甲基亞砜(DMSO)溶解備用;鹽酸地爾硫艸卓注射液;肝素鈉注射液;細胞凋亡原位檢測試劑盒;羊ASK1多克隆抗體;鼠Cyt-C多克隆抗體;鼠Bax多克隆抗體;Bcl-2鼠抗人多克隆抗體;IgGHRP;Immobilon-P試劑盒。③儀器:動物呼吸機器(上海奧爾科特生物科技有限公司);Western電泳儀(美國Bio-Rad公司);武漢俊杰JB-L5生物組織石蠟包埋機;Shandon切片機;奧林巴斯光學顯微鏡;重慶天海彩色病理圖像分析系統。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及處理 將60只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、溶媒組、YLSC低劑量組、YLSC高劑量組、地爾硫組，每組10只。各組均于造模前10 min通過尾靜脈注射藥物2 mL/kg，所用藥物前兩組為生理鹽水;溶媒組為含0.5%DMSO的生理鹽水;YLSC低劑量、高劑量組為2.5 、5.0 mg/kg的YLSC;地爾硫組為鹽酸地爾硫注射液2.0 mL/kg。各組均按照文獻［3］復制大鼠心肌缺血再灌注模型。以ST段抬高0.1 mV或T波高聳，心肌變為暗紅色作為心肌缺血標志;以ST段降低，T波逐漸恢復作為再灌注成功標志。假手術組僅穿線不結扎。實驗結束后立即處死，取心肌組織用于下述實驗。

1.2.2 心肌細胞凋亡率檢測 用TUNEL法檢測心肌凋亡細胞的分布情況。將每個心臟標本切為5片，每片取5個陽性視野，即每個標本計25個視野。正常細胞核呈藍色;凋亡細胞核呈棕黃色，細胞核邊集、染色質固縮、細胞體積變小，以陽性細胞數占總細胞數的百分比作為細胞凋亡率。

1.2.3 ASK1、Cyt-C、Bcl-2、Bax 蛋白表達檢測 采用Western blot法檢測抽提組織蛋白，Bradford法計算蛋白含量。取100μg蛋白樣品，經十二烷基磺酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳、轉膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉后加入相應稀釋倍數的一抗(ASK1、Cyt-C、Bcl-2、Bax的抗體體積比分別為1∶2000，1∶500、1∶4000、1∶4000)，4℃孵育過夜。TTBS洗膜3次后加入相應的二抗工作液(兔抗羊IgG體積比為1∶2 000，馬抗鼠 IgG體積比為1∶1 000)，室溫孵育2 h，Immobilon-P 試劑盒顯影成像。用Quantity One軟件分析蛋白條帶的光密度值，以目的條帶的光密度值/內參GAPDH的光密度值作為蛋白的相對表達量。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行統計學處理。計量數據以ˉx±s表示、組間比較采用t檢驗，率的比較行χ2檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 心肌細胞凋亡情況 假手術組僅見個別散在的凋亡細胞;余五組凋亡細胞明顯增加，YLSC低、高劑量組及地爾硫艸卓組凋亡細胞數均顯著少于模型組(P＜0.01)，其中YLSC高劑量組顯著少于低劑量組(P ＜0.05)，見表1。

表1 六組細胞凋亡率及凋亡蛋白表達(n=10，ˉx±s)

2.2 ASK1、Cyt-C、Bcl-2、Bax 蛋白表達 與假手術組比較，余五組ASK1、Cyt-C蛋白表達均明顯降低(P ＜0.05或 P ＜0.01)，Bcl-2 蛋白表達明顯升高(P＜0.01);與模型組相比，YLSC低、高劑量組 ASK1、Cyt-C、Bax蛋白表達均明顯降低(P＜0.05或 P＜0.01)，Bcl-2 蛋白表達明顯升高(P ＜0.01)，且呈YLSC劑量依賴性，見表1。

3 討論

細胞凋亡在心肌缺血再灌注過程中起重要作用。在心肌缺血早期即可出現細胞凋亡，而在再灌注后細胞凋亡可變為爆發性增加［4］。細胞凋亡可使心肌細胞數量變少，心肌變薄伸展，功能性心肌梗死面積擴大，故梗死早期梗死面積的大小更多取決于細胞凋亡的嚴重程度［5］。盡早恢復血供，減少缺血再灌注引起的細胞凋亡，具有理論和臨床實踐雙重意義。

心肌細胞凋亡由眾多信號分子參與調節。ASK1處于凋亡信號調節的上游階段，是p38活化蛋白激酶和 c-Jun NH2末端酶的上游激活因子。ASK1在炎癥、氧化和應激狀態下可被激活，表現為硫氧還原蛋白從ASK1上解離出來，激活的ASK1在調節細胞生長、生存和死亡方面起重要作用［6］。Cyt-C在細胞凋亡中亦起關鍵作用，可激活下游的caspase效應器，產生一系列的級聯反應，從而引起細胞凋亡。Cyt-C的作用受Bcl-2蛋白家族調節，其中抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL連接于線粒體外膜，可抑制Cyt-C自線粒體中釋放，阻止Ca2+自內質網釋放［7］;相反，促凋亡蛋白(如Bax)可促使Cyt-C和線粒體內膜其他蛋白質自線粒體中釋放。Bcl-2與Bax的比值可間接反映細胞受凋亡因子調節的程度，改善Bcl-2和(或)Bax蛋白表達，增加Bcl-2/Bax值，可降低缺血再灌注后細胞凋亡率［8］。本研究顯示，假手術組僅見個別散在的凋亡細胞，模型組凋亡細胞明顯多于假手術組，YLSC低、高劑量組及地爾硫艸卓組凋亡細胞數均顯著少于模型組，其中YLSC高劑量組顯著少于低劑量組;與模型組相比，YLSC低、高劑量組ASK1、Cyt-C、Bax蛋白表達均明顯降低，Bcl-2蛋白表達明顯升高，且呈YLSC劑量依賴性。提示YLSC能降心肌缺血再灌注大鼠的心肌細胞凋亡率，增加抗凋亡蛋白如Bcl-2的表達，抑制促凋亡蛋白如ASK1、Cyt-C、Bax的表達，對缺血心肌具有明顯保護作用。

綜上所述，YLSC能明顯減輕缺血再灌注損傷誘導的心肌細胞凋亡，其機制可能與上調Bcl-2蛋白表達、下調ASK1、Cyt-C、Bax蛋白表達有關。

［1］簡潔，林興，張士軍，等.玉郎傘兩種黃酮單體的抗氧化、耐缺氧和抗凝血作用研究［J］.中藥藥理與臨床，2009，25(3):22-23.

［2］簡潔，劉曦，黃仁彬，等.玉郎傘兩種黃酮單體對心肌細胞缺氧/復氧損傷的保護作用［J］.中國藥理學通報，2009，25(7):942-945.

［3］宋張娟，邱曉曉，王青，等.蛋白激酶C活性對缺血再灌注心肌環氧化酶表達的影響［J］.山東醫藥，2011，51(23):4-6.

［4］Assayag M，Gerstenblith G，Stern MD，et al.Long-but not shortterm heat acclimation produces an apoptosis-resistant cardiac phenotype:a lesson from heat stress and ischemic/reperfusion insults［J］.Cell Stress Chaperones，2010，15(5):651-664.

［5］彭章平，朱建華.現代缺血性心臟病學［M］.北京:人民軍醫出版社，2000:401.

［6］Yamaguchi O，Higuchi Y，Hirotani S，et al.Targeted deletion of apoptosis signal-regulating kinase1 attenuates left ventricular remodeling［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(26):15883-15888.

［7］Zhang M，Zhang HQ，Xue SB.Effect of Bcl-2 and caspase-3 on calcium distribution in apoptosis of HL-60 cell［J］.Cell Res，2000，10(3):213-220.

［8］Skommer J，Wlodkowic D，Deptala A.Larger than life:Mitochondria and the Bcl-2 family［J］.Leuk Res，2007，31(3):227-286.