Notch1活化對骨髓瘤細胞株RPMI8226增殖及藥物敏感性的影響

郭冬梅，李玉娟，李純璞，白觀臣，陳 晨，滕清良

(泰安市中心醫院，山東泰安271000)

多發性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)是一種發生于B淋巴細胞的惡性漿細胞病，好發于中老年人，發病機制尚不明確，目前主要采用化療、放療、免疫及造血干細胞移植治療。近年來，新型藥物的應用使MM患者生存期有所延長，但仍有較多患者發生耐藥及復發［1，2］。新近研究表明，Notch1 信號通路在多種腫瘤的發生、發展、耐藥及預后中具有重要作用。2010年1月～2011年10月，我們利用攜帶Notch1-ICN的逆轉錄病毒載體感染MM細胞株RP MI8226，觀察外源性Notch1信號對對MM細胞株RPMI8226增殖、周期改變及藥物敏感性的影響，旨在探索Notch1通路在MM發生、發展及耐藥中的作用，尋找MM治療的新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 人 MM 細胞株 RPMI8226，Notch1-ICN病毒(由目的基因質粒 pMSCV-ICN/GFP、包裝質粒pKat和編碼水泡性口膜炎病毒G-糖蛋白的包膜質粒pCMV-VSV-G包裝而成)及對照病毒(CON)由山東大學齊魯醫院惠贈;CCK-8測定細胞增殖的試劑盒(上海凱基生物技術有限公司)，兔抗人Notch1單克隆抗體(Abcam公司)，碘化丙啶(Propidium iodide，PI，美國 BD 公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養、處理及鑒定 ①細胞培養、處理:取人MM細胞株RPMI8226置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養，細胞生長至對數生長期后用于后續實驗。首日按照每孔2×105/mL鋪24孔板，同時加入0.5 mL病毒上清及Polybrene(8μg/mL)于培養箱中培養1 h，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液過夜;第2、3天，離心棄培養液，PBS洗1次，重復第1天步驟。采用限制性稀釋方法獲得單個細胞，篩選穩定感染細胞。獲取RPMI8226-ICN及RPMI8226-CON細胞(分別為病毒組及病毒對照組)，同時設未經感染的細胞為未轉染組。②鑒定:選取上述三組細胞，裂解后收集蛋白樣品，采用Western blot法檢測Notch1-ICN蛋白表達，按試劑盒說明書操作。

1.2.2 細胞增殖情況檢測 按每孔5×103個細胞將上述三組細胞接種于96孔細胞培養板，置CO2孵箱培養4 d，其后按照CCK-8試劑盒說明操作，每孔加入10 μL的 CCK-8液，分別于24、48、72、96 h后在酶標儀波長450 nm處測定吸光度值(A值)。每個樣本設3個復孔，實驗重復3次。

1.2.3 藥物敏感性檢測 選取1.2.1中三組細胞，按1×103/孔接種于96孔細胞培養板。根據預實驗結果和文獻報道，分別將濃度為 0.2、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2 μmol/L 的硼替佐米加入培養體系中，培養48 h后按照CCK-8試劑盒說明操作，在酶標儀波長450 nm處測定吸光度值(A值)。根據公式(1－用藥組平均A值/對照組平均A值)×100%計算細胞抑制率。每個樣本設3個復孔，實驗重復3次。以時間為橫坐標、A值為縱坐標繪制細胞增殖曲線。

1.2.4 細胞周期檢測 選取1.2.1中三組細胞制備細胞懸液，用PBS洗2次，調整細胞密度為1×106/mL;1 000 r/min離心10 min;用75%冰乙醇懸浮，4℃過夜固定;次日PBS洗滌，1 000 r/min離心10 min，去除乙醇;分別加入500 L含有RNaseA的PI溶液，4℃避光30 min;用流式細胞儀測定單個細胞核中PI-DNA含量，用摻入的PI熒光強度反映單個細胞核中DNA含量，測定細胞周期。

1.3 統計學方法 采用統計學軟件SPSS13.0分析數據。計量數據以ˉx±s表示，采用t檢驗，檢驗水準α =0.05。

2 結果

2.1 轉染細胞鑒定 病毒組細胞Notch1-ICN蛋白表達水平約為病毒對照組及未轉染組的2.5倍，見圖1。

圖1 三組RPMI8226細胞Notch1蛋白表達

2.2 細胞增殖情況和對硼替佐米藥物的敏感性培養后48、72、96 h病毒組細胞增殖率均顯著高于病毒對照組(P均＜0.01)，見圖2;隨硼替佐米濃度增高，各組細胞抑制作用均逐漸增加，且同濃度條件下病毒組抑制率顯著低于病毒對照組及未轉染組，見表1。

圖2 病毒組和病毒對照組細胞增殖曲線

表1 不同濃度硼替佐米作用下三組細胞增殖抑制率(n=3，%，ˉx ±s)

2.3 細胞周期 病毒組S期細胞比例明顯高于其余兩組(P 均 ＜0.01)，見圖3。

3 討論

圖3 三組細胞周期比例

研究顯示，造血系統的多種惡性疾病如白血病、淋巴瘤和MM中均存在Notch活化。Notch信號異常與多種腫瘤的發病、細胞周期阻滯和治療預后有關。新近研究顯示，Notch信號在不同腫瘤組織及腫瘤發展的不同階段均可發揮促癌或抑癌作用。Xu等［3］研究顯示，激活Notch信號可加快MM病情進展。Nefedova等的細胞周期實驗結果顯示，Notchl-ICN可上調S期RPMI8226細胞比例，進而促進細胞生長。賈向旭等［5］發現，病毒感染細胞可通過上調Notch1-ICN表達抑制細胞凋亡。Nefedova等［6］研究顯示，阻斷Notch1通路可導致細胞周期阻滯及細胞凋亡增加，并可增加細胞對化療藥物的敏感性。

為研究Notch信號通路在MM發生、發展中的作用，本研究采用逆轉錄病毒體系轉染細胞，其特點為高效地將目的基因整合到染色體上穩定表達。結果顯示，應用Notch1-ICN感染MM細胞后病毒組Notch1-ICN表達明顯上調，約為病毒對照組和未轉染組的2.5倍;培養后48、72、96 h病毒組細胞增殖率均顯著高于病毒對照組。提示上調Notchl表達可促進RPMI8226細胞增殖。以硼替佐米為代表的新型靶向藥物的出現使MM患者的緩解率和總生存率顯著改善，但大部分患者仍然出現復發或耐藥。為研究Notch1表達上調對藥物敏感性的影響，本研究選擇硼替佐米用于實驗，結果顯示隨硼替佐米濃度增高，各組細胞抑制作用均逐漸增加，且同濃度條件下病毒組抑制率顯著低于病毒對照組及未轉染組。說明Notch1通路活化可使RPMI8226細胞對硼替佐米敏感性降低。此外，本研究還顯示病毒組S期細胞比例明顯高于其余兩組。提示外源性Notchl活化可通過增加S期細胞比例促進MM細胞增殖，還可降低MM細胞對硼替佐米的敏感性。

綜上所述，Notch1信號通路活化與MM的發生、發展及耐藥密切相關，有望成為MM治療的新靶點。

［1］Piro E，Kropp M，Cantaffa R，et al.Visceral leishmaniasis infection in a refractory multiple myeloma patient treated with bortezomib［J］.Ann Hematol，2012 May 15.［Epub ahead of print］

［2］Kumar SK，Lee JH，Lahuerta JJ，et al.Risk of progression and survival in multiple myeloma relapsing after therapy with IMiDs and bortezomib:A multicenter international myeloma working group study［J］.Leukemia，2012，26(5):1153.

［3］Xu D，Hu J，Xu S，et al.Dll1/Notch activation accelerates multiple myeloma disease development by promotingMM-cell proliferation［J］.Leukemia，2011，Nov 18.doi:10.1038/leu.2011.332.［Epub ahead of print］

［4］Nefedova Y，Sullivan DM，Bolick SC，et al.Inhibition of Notch signaling induces apoptosis of myeloma cells and enhances sensitivity to chemotherapy［J］.Blood，2008，111(4):2220-2229.

［5］賈向旭，魯茁壯，王華，等.激活Notch信號抑制多發性骨髓瘤細胞凋亡［J］.中國實驗血液學雜志，2004，12(3):335-339.