紫外-可見分光光度法測(cè)定細(xì)氈毛忍冬中總黃酮的含量

鄭光雅，馬逾英，翟萌，穆向榮，金麗鑫

金銀花為常用中藥，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱等功效，廣泛應(yīng)用已有悠久歷史，為治療各種熱病、風(fēng)病、溫病的首選藥物。金銀花除供藥用外，還廣泛應(yīng)用于食品、保健品、護(hù)膚品、日用化工等。川產(chǎn)金銀花主流品種為細(xì)氈毛忍冬Lonicera similes Hemsl，該種資源豐富，使用歷史悠久。

細(xì)氈毛忍冬的主要成分除有機(jī)酸外，還含黃酮類、皂苷類、環(huán)烯醚萜及揮發(fā)油等。其中黃酮類化合物是一類生物活性很強(qiáng)的化合物，具有抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗癌防癌的功效[1]，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。目前對(duì)黃酮類化合物含量測(cè)定方法的研究甚多，研究表明目前總黃酮含量測(cè)定以分光光度法為主，此方法在金銀花[2]、枸杞[3]、鳳仙花[4]、南紅豆杉[5]、甘草[6]、黃芪[7]等眾多中藥的總黃酮含量測(cè)定中得到了廣泛應(yīng)用。

本文以蘆丁為對(duì)照品，采用紫外-可見分光光度法在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定細(xì)氈毛忍冬中的總黃酮含量，對(duì)細(xì)氈毛忍冬的化學(xué)成分及其含量有一個(gè)系統(tǒng)、全面的了解，為深入研究并綜合開發(fā)川產(chǎn)金銀花的主流品種細(xì)氈毛忍冬的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 藥材

實(shí)驗(yàn)所用細(xì)氈毛忍冬藥材采購(gòu)于四川省南江縣，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)馬逾英教授鑒定，為忍冬科植物細(xì)氈毛忍冬Lonicera similis Hemsl。

1.2 試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（由中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所提供，批號(hào)：100080-200707）；無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均由成都市科龍化工試劑廠提供；蒸餾水（自制）。

1.3 儀器設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-5203（上海亞榮生化儀器廠）；循環(huán)水式多用真空泵SHB-Ⅲ（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；電子天平TD6001（天津天與儀器廠）；紫外-可見分光光度計(jì)UV1100（上海天美科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

細(xì)氈毛忍冬干燥花蕾4.75 g，采用文獻(xiàn)方法[8～9]進(jìn)行提取，即用90%、80%、70%的乙醇回流提取，物料比為1∶8，過(guò)濾，減壓回收乙醇，得浸膏0.95 g，（即1 g浸膏相當(dāng)于5 g生藥量）。精密吸取浸膏0.5 g，置50 mL容量瓶中，加75%乙醇適量，超聲處理使溶解，放冷，加75%乙醇至刻度，搖勻。精密量取1.0 mL，置50 mL容量瓶中，加75%乙醇至刻度，搖勻，即得（濃度為0.001g生藥 mL-1）。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取蘆丁對(duì)照品約25 mg，置50 mL容量瓶中，加75%乙醇適量，超聲處理使溶解，放冷，加75%乙醇至刻度，搖勻。精密量取20 mL，置50 mL容量瓶中，加75%乙醇至刻度，搖勻，即得（濃度為0.2 mg mL-1）。

2.3 波長(zhǎng)的選定

精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液和供試品溶液適量，以亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色，空白試劑為對(duì)照，于200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。結(jié)果表明，對(duì)照品溶液在510.5 nm處有最大吸收，供試品溶液在509.3 nm處有最大吸收，如圖1所示。

由于供試品中黃酮種類多，造成最大吸收與對(duì)照品有微小的差異，考慮到以對(duì)照品來(lái)計(jì)含量，故選擇510nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.4 線性關(guān)系的考察

圖1 蘆丁對(duì)照品溶液和供試品溶液UV-VIS掃描圖Fig 1 UV-VIS scans of rutin standard solution and sample solution

精密量取對(duì)照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，分別置25 mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加10%氫氧化鈉溶液1.0 mL，再加水定容至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見分光光度法（《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄VA），于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，濃度C（μg mL-1）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

求得回歸方程：A=0.0137C+0.0008，r=0.9999，n=6。測(cè)定結(jié)果見表1、圖2。結(jié)果表明，蘆丁對(duì)照品溶液在8.0179～48.1074 μg mL-1濃度范圍內(nèi)，吸光度與濃度呈良好線性關(guān)系。

圖2 蘆丁對(duì)照品溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig 2 The standard curve of rutin standard solution

表1 蘆丁對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制結(jié)果Table 1 Results of the standard curve of rutin standard solution

2.5 精密度試驗(yàn)

精密量取對(duì)照品溶液0.2 mL，置于10 mL容量瓶中，用75%乙醇定容，于510 nm處測(cè)定其吸光度，重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值(RSD)。

測(cè)得細(xì)氈毛忍冬總黃酮含量的RSD值為0.31%，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取4.7508 g細(xì)氈毛忍冬，按“2.1”方法制成供試液，于510 nm處測(cè)其吸光度，每隔30 min測(cè)1次，連續(xù)測(cè)定6次計(jì)算RSD值。

測(cè)得細(xì)氈毛忍冬總黃酮含量RSD值為0.32%，表明試驗(yàn)在3小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定，滿足測(cè)定要求。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一批細(xì)氈毛忍冬樣品5份，按“2.1”方法制成供試液，于510 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品含量及RSD值。

結(jié)果表明，5次測(cè)得的平均含量為3.38% ，RSD值為0.66% ，說(shuō)明該方法的重復(fù)性良好。

2.8 樣品含量測(cè)定

表2 樣品中總黃酮含量測(cè)定結(jié)果Table 2 Results of determination of total fl avonoids in samples

精密稱取4.7502 g細(xì)氈毛忍冬，按“2.1”方法制備樣品供試液，以75%乙醇作為空白對(duì)照，于510 nm處測(cè)定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總黃酮的含量。

結(jié)果見表2，計(jì)算得樣品中總黃酮含量為3.38%。

3 結(jié)論與討論

蘆丁是細(xì)氈毛忍冬中的主要黃酮類成分，以蘆丁為對(duì)照品測(cè)定細(xì)氈毛忍冬中總黃酮的含量，結(jié)果較可靠。

該研究在對(duì)細(xì)氈毛忍冬中總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定時(shí)，分別嘗試了用濃HC1-Mg粉法和NaNO2-A1(NO3)3-NaOH法進(jìn)行測(cè)定，前者因存在色素類成分的干擾，不能用于細(xì)氈毛忍冬總黃酮的含量測(cè)定；后者操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，對(duì)儀器要求不高，可作為細(xì)氈毛忍冬中總黃酮含量的檢測(cè)方法。除此以外，該研究對(duì)顯色劑的用量和顯色時(shí)間進(jìn)行了考察，結(jié)果表明：室溫下放置6 min樣品液，吸光度基本穩(wěn)定；加入10%NaOH溶液1 mL顯色，吸光度值較為適中。

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