紫外-可見分光光度法測定細氈毛忍冬中總黃酮的含量

鄭光雅，馬逾英，翟萌，穆向榮，金麗鑫

金銀花為常用中藥，具有清熱解毒、疏散風熱等功效，廣泛應用已有悠久歷史，為治療各種熱病、風病、溫病的首選藥物。金銀花除供藥用外，還廣泛應用于食品、保健品、護膚品、日用化工等。川產金銀花主流品種為細氈毛忍冬Lonicera similes Hemsl，該種資源豐富，使用歷史悠久。

細氈毛忍冬的主要成分除有機酸外，還含黃酮類、皂苷類、環烯醚萜及揮發油等。其中黃酮類化合物是一類生物活性很強的化合物，具有抗衰老、增強機體免疫力、抗癌防癌的功效[1]，在醫藥、食品等領域具有廣闊的應用前景。目前對黃酮類化合物含量測定方法的研究甚多，研究表明目前總黃酮含量測定以分光光度法為主，此方法在金銀花[2]、枸杞[3]、鳳仙花[4]、南紅豆杉[5]、甘草[6]、黃芪[7]等眾多中藥的總黃酮含量測定中得到了廣泛應用。

本文以蘆丁為對照品，采用紫外-可見分光光度法在波長510 nm處測定細氈毛忍冬中的總黃酮含量，對細氈毛忍冬的化學成分及其含量有一個系統、全面的了解，為深入研究并綜合開發川產金銀花的主流品種細氈毛忍冬的藥用價值和經濟價值提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 藥材

實驗所用細氈毛忍冬藥材采購于四川省南江縣，經成都中醫藥大學馬逾英教授鑒定，為忍冬科植物細氈毛忍冬Lonicera similis Hemsl。

1.2 試劑

蘆丁標準品（由中國藥品生物制品檢驗所提供，批號：100080-200707）；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均由成都市科龍化工試劑廠提供；蒸餾水（自制）。

1.3 儀器設備

旋轉蒸發儀RE-5203（上海亞榮生化儀器廠）；循環水式多用真空泵SHB-Ⅲ（鄭州長城科工貿有限公司）；電子天平TD6001（天津天與儀器廠）；紫外-可見分光光度計UV1100（上海天美科技有限公司）。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

細氈毛忍冬干燥花蕾4.75 g，采用文獻方法[8～9]進行提取，即用90%、80%、70%的乙醇回流提取，物料比為1∶8，過濾，減壓回收乙醇，得浸膏0.95 g，（即1 g浸膏相當于5 g生藥量）。精密吸取浸膏0.5 g，置50 mL容量瓶中，加75%乙醇適量，超聲處理使溶解，放冷，加75%乙醇至刻度，搖勻。精密量取1.0 mL，置50 mL容量瓶中，加75%乙醇至刻度，搖勻，即得（濃度為0.001g生藥 mL-1）。

2.2 對照品溶液的制備

取蘆丁對照品約25 mg，置50 mL容量瓶中，加75%乙醇適量，超聲處理使溶解，放冷，加75%乙醇至刻度，搖勻。精密量取20 mL，置50 mL容量瓶中，加75%乙醇至刻度，搖勻，即得（濃度為0.2 mg mL-1）。

2.3 波長的選定

精密吸取蘆丁對照品溶液和供試品溶液適量，以亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色，空白試劑為對照，于200～800 nm波長范圍內掃描。結果表明，對照品溶液在510.5 nm處有最大吸收，供試品溶液在509.3 nm處有最大吸收，如圖1所示。

由于供試品中黃酮種類多，造成最大吸收與對照品有微小的差異，考慮到以對照品來計含量，故選擇510nm為測定波長。

2.4 線性關系的考察

圖1 蘆丁對照品溶液和供試品溶液UV-VIS掃描圖Fig 1 UV-VIS scans of rutin standard solution and sample solution

精密量取對照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，分別置25 mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加10%氫氧化鈉溶液1.0 mL，再加水定容至刻度，搖勻，放置15 min，以相應試劑為空白，照紫外-可見分光光度法（《中國藥典》2010年版一部附錄VA），于510 nm波長處測定吸光度。以吸光度（A）為縱坐標，濃度C（μg mL-1）為橫坐標，繪制標準曲線。

求得回歸方程：A=0.0137C+0.0008，r=0.9999，n=6。測定結果見表1、圖2。結果表明，蘆丁對照品溶液在8.0179～48.1074 μg mL-1濃度范圍內，吸光度與濃度呈良好線性關系。

圖2 蘆丁對照品溶液標準曲線圖Fig 2 The standard curve of rutin standard solution

表1 蘆丁對照品標準曲線繪制結果Table 1 Results of the standard curve of rutin standard solution

2.5 精密度試驗

精密量取對照品溶液0.2 mL，置于10 mL容量瓶中，用75%乙醇定容，于510 nm處測定其吸光度，重復測定5次，計算相對標準偏差值(RSD)。

測得細氈毛忍冬總黃酮含量的RSD值為0.31%，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩定性試驗

精密稱取4.7508 g細氈毛忍冬，按“2.1”方法制成供試液，于510 nm處測其吸光度，每隔30 min測1次，連續測定6次計算RSD值。

測得細氈毛忍冬總黃酮含量RSD值為0.32%，表明試驗在3小時內穩定，滿足測定要求。

2.7 重復性試驗

稱取同一批細氈毛忍冬樣品5份，按“2.1”方法制成供試液，于510 nm處測定吸光度，計算樣品含量及RSD值。

結果表明，5次測得的平均含量為3.38% ，RSD值為0.66% ，說明該方法的重復性良好。

2.8 樣品含量測定

表2 樣品中總黃酮含量測定結果Table 2 Results of determination of total fl avonoids in samples

精密稱取4.7502 g細氈毛忍冬，按“2.1”方法制備樣品供試液，以75%乙醇作為空白對照，于510 nm處測定吸光度，代入標準曲線計算樣品中總黃酮的含量。

結果見表2，計算得樣品中總黃酮含量為3.38%。

3 結論與討論

蘆丁是細氈毛忍冬中的主要黃酮類成分，以蘆丁為對照品測定細氈毛忍冬中總黃酮的含量，結果較可靠。

該研究在對細氈毛忍冬中總黃酮含量進行測定時，分別嘗試了用濃HC1-Mg粉法和NaNO2-A1(NO3)3-NaOH法進行測定，前者因存在色素類成分的干擾，不能用于細氈毛忍冬總黃酮的含量測定；后者操作簡單，準確度高，重現性好，對儀器要求不高，可作為細氈毛忍冬中總黃酮含量的檢測方法。除此以外，該研究對顯色劑的用量和顯色時間進行了考察，結果表明：室溫下放置6 min樣品液，吸光度基本穩定；加入10%NaOH溶液1 mL顯色，吸光度值較為適中。

[1] 張彬,李彩俠,吳亞卿.黃酮類化合物的研究進展[J].食品與藥品,2005,2l(5):70.

[2] 宋琳琳,冉軍艦.金銀花中總黃酮提取條件優化研究[J].安徽農業科學,2008,36(32):14151.

[3] 張穎,張立睦,周紅英.不同產地枸杞子中黃酮含量的測定[J].中國中醫藥科技,2004,11(2):102.

[4] 李曉明,姜華,李軍,等.分光光度法測定鳳仙花中總黃酮的含量[J].安徽農業科學,2009,37(33):16378.

[5] 孔繁晟,嚴春艷,賁永光,等.紫外分光光度法測定云南紅豆杉枝葉中總黃酮的含量[J].時珍國醫國藥,2009,20(2):471.

[6] 周斌,常軍,劉可越,等.紫外分光光度法測定甘草中總黃酮的含量[J].安徽農業科學,2009,37(31):15246.

[7] 董順福,韓麗琴,劉建華,等.黃芪等中藥總黃酮與金屬元素含量測定及聚類分析[J].時珍國醫國藥,2010,21(3):650.

[8] 許小方,李會軍,李萍,等.灰氈毛忍冬花蕾中的化學成分[J].中國天然藥物,2006,4(1):45.

[9] 羅詠婧,李會軍,李萍等.毛花柱忍冬花蕾化學成分研究[J].林產化學與工業,2010,30(1):73.