胃寧膠囊對胃潰瘍大鼠胃黏膜EGF及EGFR mRNA表達的影響

劉敬，趙斌，王瓊，謝朝良

胃潰瘍是消化系統常見疾病，胃寧膠囊用于脾胃氣虛、肝胃不和所致的胃脘疼痛、喜按、嘔吐酸水、胃潰瘍及胃痛見上述癥候者。前期藥效學實驗表明胃寧膠囊具有很好的抗潰瘍作用，本實驗通過研究胃寧膠囊對大鼠胃黏膜EGF及EGFR mRNA表達水平的影響，探索其抗潰瘍的作用機理。

1 實驗部分

1.1 藥品與動物

胃寧膠囊（規格：0.4 g/粒，由成都中醫藥大學制劑教研室提供，批號：100301、100302、100303，三批等量混合使用）；大鼠，SD種，普通級，體重170.2～190.9 g，雌雄各半（由成都中醫藥大學實驗動物研究中心提供，動物質量合格證：SCXK(川)2008-11號）。

1.2 統計方法

各組數據均用x±s表示，采用spss11.5統計軟件進行處理。

1.3 實驗方法[1]

1.3.1 造模 取健康SD大鼠24只，雌雄各半，按性別隨機搭配分成3組，每組8只，分別作為：①模型對照組：純凈水1 mL/100 g體重；②胃寧膠囊治療組：0.6 g.kg-1(濃度為0.06 g.mL-1，給藥容量均為1 mL/100 g體重)。 ③正常對照組：正常飼養。①、②組動物灌胃給藥，每天1次，第5天給藥后禁食不禁水48 h，第7次給藥后4 h, 將大鼠在乙醚麻醉下剖腹，于幽門和十二指腸交界處結扎，將大鼠行幽門結扎性胃潰瘍模型，禁食禁水，19 h后放血處死大鼠，取胃黏膜。實驗用器械均以0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的器械消毒液浸泡12 h以上，玻璃器皿則干烤200℃ 5 h以上，滅活RNA酶。正常對照組于腺胃前壁近幽門處，其余各組沿潰瘍周圍取下約1×1 cm2大小的胃壁，冰生理鹽水沖洗干凈，用無菌濾紙小心拭干，迅速放入液氮中冷存，用RT-PCR檢測胃黏膜組織EGF及EGFR mRNA的表達水平。

1.3.2 總RNA的提取與定量 分別取大鼠胃黏膜，約100 mg置加有1 mLTrizol 裂解液的無菌離心管中，電動勻漿器勻漿，吸取組織裂解液加到1.5 mL無菌EP管中，室溫放置5 min，Trizol試劑盒法確定總RNA的質量及純度。

1.3.3 單鏈cDNA的合成 按照RT-PCR一步法擴增試劑盒方法，分別以胃黏膜組織總RNA為模板進行RT-PCR擴增。各目的基因的引物序列、產物大小如下: 大鼠EGF特異性引物正義鏈：5′–TCG GTG CTG TGC GAT TTA–3′，反義鏈：5′–TGG TGG GCA GGT GTC TTT–3′，擴增片斷長度為367bp；大鼠EGFR特異性引物正義鏈：5′–AGC GAG GCT GAC AAG AAG A–3′，反義鏈：5′–CAC CCG CAC CCT GAT ACA–3′，擴增片斷長度為378bp。內標參照管家基因GAPDH(glyceraldehyde–3–phosphate dehydrogenas)正義鏈：5′–ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC–3′，反義鏈：5′–TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA–3′，擴增片斷長度為485bp。RT-PCR反應體系為25 μL，包括0.5 μg.μL-1總RNA 1μL，10×Taq酶緩沖液2.5 μL，dNTPs 2.5 μL，MgCl25 μL, Taq酶、AMV、Inhibitor各0.5 μL，GAPDH引物、EGFR引物各1 μL，溶于8 μL無RNA酶去離子水中。反應條件為：取RT-PCR產物7 μL，以DL2000為Marker, 經

1.5%瓊脂糖凝膠90 V電泳30 min，0.5 mg.mL-1溴乙錠溶液染色，凝膠成像分析。以GAPDH作為內參照，計算機灰度掃描求積定量，用目的基因條帶與

GAPDH灰度比值表示EGF及EGFR mRNA表達水平。

1.4 實驗結果

1.4.1 胃寧膠囊對EGF mRNA的影響 與正常組比較，模型組及胃寧膠囊組大鼠胃黏膜組織對機體保護作用的EGF mRNA的表達水平較正常組明顯上調(P<0.01)；與模型組比較，胃寧膠囊組EGF mRNA表達水平明顯上調(P<0.01)。結果見表1。

1.4.2 胃寧膠囊對EGFR mRNA的影響 與正常組比較，模型大鼠胃黏膜組織對機體保護作用的EGFR mRNA的表達水平較正常組上調，但無統計學意義(P＞0.05)，胃寧膠囊組大鼠胃黏膜組織對機體保護作用的EGFR mRNA的表達水平明顯上調(P<0.01)；與模型組比較，胃寧膠囊組EGFR mRNA表達水平明顯上調(P<0.05)。結果見表1。

表1 胃寧膠囊對胃潰瘍模型大鼠胃黏膜EGF及EGFR mRNA表達水平的影響 ( x±s)

2 結論

胃寧膠囊能顯著提高大鼠胃黏膜中EGF及EGFR mRNA表達水平，提示其抗潰瘍作用與細胞因子的介導有關。

3 討論

消化性潰瘍是臨床常見多發性疾病，現代醫學認為潰瘍發生是黏膜侵襲因素和防御因素失衡的結果。文獻報道，中藥對實驗性胃潰瘍的作用機制主要從減弱胃潰瘍的攻擊因子、增強胃黏膜防御因子和改善中樞神經功能的傳導等方面起作用。本實驗從胃寧膠囊對大鼠胃黏膜EGF及EGFR mRNA表達水平影響來探討其抗潰瘍的作用機理。

EGF在維持胃腸黏膜完整性、保護胃黏膜免受損傷因子破壞方面起著非常重要的作用[2～3]，對胃潰瘍的發生、發展和愈合均有影響。 EGF是一種有效的促分裂素，其主要功能是促進細胞增生，參與胃腸上皮細胞的增生、成熟、分化，在生理條件下調節胃腸道的生長發育。此外EGF具有營養和保護胃腸道作用。黏膜損害和HP（幽門螺桿菌）感染時胃黏膜EGF蛋白水平和EGFR mRNA的表達水平增加，而唾液中的EGF的濃度不受影響[4]。潰瘍發生后EGF等生長因子表達水平上調可以促進再生黏膜細胞遷移進入新生肉芽組織，修復黏膜疤痕中腺體結構[5]，刺激黏膜和/或重碳酸鹽分泌，增加局部血流量，以及釋放多種細胞保護因子[6]。EGF是近年發現的在細胞增殖和分化中起重要作用的分子[7]，更是再生黏膜功能成熟度的重要指標。

EGFR對EGF有高度特異性和親和力，廣泛存在于多種上皮細胞膜上。當EGF到達靶細胞表面時，很快與細胞膜上EGFR結合，誘導其變構，形成受體二聚體，激活受體膜內區域的酪氨酸蛋白激酶，使自身的一系列酪氨酸被磷酸化，調節細胞生長與分化。

本研究采用了RT-PCR技術，探討了胃寧膠囊對EGF及EGFR mRNA在胃潰瘍大鼠胃黏膜中表達的干預作用。實驗結果顯示經幽門結扎造模損傷后，模型大鼠胃黏膜組織應激刺激，對機體保護作用的EGF及EGFR mRNA的表達水平與正常對照組相比明顯上調，而胃寧膠囊處理后EGF及EGFR mRNA表達水平進一步上調，胃寧膠囊可明顯增強胃潰瘍邊沿上皮EGF及EGFR mRNA的表達，提示胃寧膠囊的抗潰瘍機制可能通過激活EGF/EGFR系統，增強胃黏膜的保護作用，而促進潰瘍愈合。

[1] 謝秀瓊主編.中藥新制劑開發與應用[M].北京:人民衛生出版社,2006:440.

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[3] 陳蔚文,李茹柳,徐頌芬,等.加味左金丸抑酸止痛作用的臨床觀察及實驗研究[J].中藥藥理與臨床,1995(6):45.

[4] 劉偉.EGF與胃腸關系新進展[J].國外醫學消化系疾病分冊,2002,22(4):207.

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[6] 羅紅,許增華,王勇,等.香砂六君子湯治療小兒HP相關性胃炎的臨床療效觀察[J].江西醫藥,2002,37(5):350.

[7] 傅智敏,朱曙東.香砂六君子湯對大鼠急性胃黏膜損傷的保護作用[J].浙江中醫學院學報,2000,24(4):52.