松花粉抗氧化活性與主要成分的關聯(lián)分析

董素哲，裴瑾，劉薇，張祎楠，萬德光

松花粉(Pollenpini)是松科植物馬尾松(Pinus massonina Lamb)、油松(Pinus tabulaefermis Carr)或同屬數(shù)種植物的干燥花粉，具有燥濕，收斂止血的功效[1]。作為祖國醫(yī)藥學寶庫中食、藥兼用的花粉品種，松花粉的應用非常廣泛。由于松花粉具有提高抗氧化能力，增強免疫功能，延緩衰老[2]等作用，本論文以清除羥基自由基、清除DPPH自由基的能力為指標，分別對不同來源松花粉的抗氧化性進行了研究；同時測定總黃酮、總甾醇與總多糖的含量，并對其與清除自由基的IC50進行多元相關分析，以探討松花粉抗氧化作用的活性部位，為松花粉質量控制和藥用資源的開發(fā)提供依據(jù)，同時也為松花粉破壁與否提供一定的參考。

1 儀器與材料

松花粉、破壁松花粉（來源詳見表1）；蘆丁對照品、D-葡萄糖對照品、β-谷甾醇對照品（中國藥品生物制品檢定所）；DPPH（美國Sigma公司）。KQ5200E型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）、UV-1100分光光度計（上海天美科學儀器有限公司）、BP121S電子天平（德國Sartorrius）等。

2 方法

2.1 抗氧化能力的測定

稱取2.0 g松花粉于錐形瓶中，加入40 mL95%乙醇超聲提取40 min，靜置，分別取上清液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL置于10 mL容量瓶中，定容，得待測液，用于清除DPPH自由基的測定。分別稱取松花粉0.1 g、0.3 g、0.5 g、0.7 g、0.9 g于錐形瓶中，加入50 mL95%乙醇超聲提取40 min，靜置，取上清液為待測液用于清除羥基自由基的測定。采用文獻[3]的方法分別測定其清除DPPH自由基與羥基自由基的能力。

2.2 總黃酮、總甾醇、總多糖的含量測定[4～6]

用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法，以蘆丁為對照品，用紫外分光光度法在500 nm處測定，標準曲線A=11.349C+0.0001，R2=0.9999，在8.08～48.48 μg.mL-1線性關系良好。用濃硫酸顯色法，以β-谷甾醇為對照品，用紫外分光光度法在416 nm處測定，標準曲線A=5.5268C-0.0019，R2=0.9996，在16.0～80.0 μg.mL-1線性關系良好。用苯酚-濃硫酸法，以D-葡萄糖為對照品，用紫外分光光度法在492 nm處測定，標準曲線A=25.327x+0.1592，R2=0.9998，在11.2～56.6 μg.mL-1線性關系良好。

2.3 量效曲線的擬合

通過檢測不同濃度的樣品對自由基的清除率，在不同濃度范圍內進行曲線擬合，以相關系數(shù)R2為指標確定樣品濃度檢測范圍，以自由基清除率為50%時樣品的濃度（IC50）來衡量樣品對自由基的清除能力，IC50越小，表明樣品清除自由基的能力越強，每種樣品取3份，平行測定，取其平均值計算。

根據(jù)自由基清除率范圍來確定樣品濃度范圍，自由基清除率在10%～90%時相關性較好，在該范圍內相關系數(shù)大于0.95，不同部位樣品量效關系呈y＝ax+b相關性，y為清除率（%），x為樣品濃度（g/mL）。

2.4 多元相關分析

分別采用SPSS17.0、OFFICE EXCEL兩種數(shù)據(jù)分析軟件對清除DPPH自由基的IC50、清除羥基自由基的IC50與總黃酮、總甾醇、總多糖的含量做多元相關性分析。

3 結果

3.1 DPPH自由基清除能力

試驗結果顯示，一定濃度范圍內樣品的對數(shù)濃度與自由基清除率呈線性關系，清除率在10%～90%時，線性關系良好，所有標準曲線的相關系數(shù)均大于0.95，因此，本方法的吸光度可較好的反映自由基清除率。IC50反映了清除自由基的能力，IC50越小，則清除自由基的能力（即抗氧化能力）越大，反之亦然。結果表明，松花粉具有良好的清除DPPH自由基的能力，不同來源的松花粉的清除能力存在一定差異，破壁松花粉的清除能力（IC50平均值為12.95 g.L-1）略高于未破壁松花粉（IC50平均值為14.86 g.L-1），詳見表1。

3.2 羥基自由基清除能力

試驗結果表明，松花粉具有良好的清除羥基自由基的能力，不同來源樣品的清除能力存在一定差異；破壁松花粉的清除羥基自由基的能力（IC50平均值為3.45 g.L-1）明顯高于未破壁松花粉（IC50平均值為20.31 g.L-1），詳見表1。

3.3 總黃酮、總甾醇、總多糖的含量

試驗結果表明，不同來源松花粉中總黃酮（0.16～0.75%）和總甾醇（0.98～7.67%）的含量差異較為明顯，而總多糖的含量則相差不大（5.25～6.98%）；破壁松花粉中總黃酮和總甾醇的平均含量分別為0.68%、4.13%，略高于未破壁松花粉，其平均含量分別為0.27%、3.94%，詳見表1。

表1 清除DPPH、羥基自由基與含量測定試驗（n=3）

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3.4 清除自由基能力與總黃酮、總甾醇、總多糖含量的關聯(lián)分析

通過多元相關分析表明，清除DPPH的IC50、清除羥基自由基的IC50分別與總黃酮、總甾醇的含量有負相關關系，與總多糖的含量有正相關關系；其中，與總黃酮含量的負相關關系最為密切，詳見表2。

表2 清除自由基能力與總黃酮、總甾醇、總多糖含量的多元相關分析

4 結論與討論

松花粉作為生命的遺傳物質，富含蛋白質、氨基酸、碳水化合物、維生素、脂類等多種營養(yǎng)成分，以及酶、輔酶、激素、黃酮、多肽、微量元素等生理活性物質，因此有“微型營養(yǎng)庫”之美譽。在國內外已被廣泛地應用于保健品、藥品、化妝品和飼料添加劑等領域。松花粉藥食兼用的歷史已逾數(shù)千年，我國利用松花粉的歷史至少可追溯到2400年前，《神農本草經》中就記載“松黃”“久服輕身益氣力，延年”，同時現(xiàn)代研究也表明松花粉具有提高抗氧化能力，增強免疫功能，延緩衰老，保護心腦血管，降低血脂等功效[7]。

本論文采用清除DPPH和羥基自由基的方法來評價松花粉的體外抗氧化活性，結果表明松花粉具有一定的抗氧化能力。松花粉清除DPPH自由基的能力優(yōu)于清除羥基自由基的能力；不同來源松花粉樣品間清除羥基自由基能力的差異較其清除DPPH自由基的能力明顯；破壁松花粉的清除能力明顯優(yōu)于未破壁松花粉，提示松花粉破壁的必要性。

黃酮與甾醇的抗氧化作用已被公認，松花粉含有多種黃酮類化合物，主要為黃酮和黃酮醇類，其次是二氫黃酮醇類。中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所研究松花粉中含有豐富的甾醇，并用二氧化碳超臨界提取物制成降血脂的產品，把植物甾醇列為產品的有效成分指標[8]。本論文測定了不同來源松花粉的總黃酮、總甾醇與總多糖的含量并對其與抗氧化性進行關聯(lián)分析，以尋找松花粉抗氧化的活性成分。結果表明不同來源的松花粉總黃酮與總甾醇的含量存在較大的差異。松花粉清除羥基自由基、清除DPPH的能力與總黃酮、總甾醇的含量呈正相關，其中，總黃酮的相關性更高。而樣品間總多糖的含量差異較小，且與抗氧化能力關聯(lián)性不大。初步推測總黃酮與總甾醇為松花粉抗氧化的活性組分，從而為以后松花粉活性成分的研究和其質量控制提供了一定的依據(jù)和基礎。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2005,147.

[2] 何曉燕.松花粉的有效成分及藥理作用[J].東北林業(yè)大學學報,2007,35(9):78.

[3] 樊青玲,張耀兮,李天才.藜葉中黃酮類化合物體外抗氧化活性研究[J].天然產物研究與開發(fā),2009,21:672.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2005,333.

[5] 莊華梅,雷然,付惠.野生半夏中β-谷甾醇含量的測定[J].湖北林業(yè)科技,2007,3:19.

[6] 劉敏,郭麗梅,張麗.苯酚-硫酸法測定油松花粉多糖含量研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2010,21(6):1526.

[7] 劉協(xié).松花粉的抗疲勞作用研究[J].中國生化藥物雜志,2004,25(3):169.

[8] 王開發(fā).花粉的植物甾醇研究[J].蜂蜜雜志,2006,9:5.