AtSDG8啟動子區域功能元件的分析

金 蘇，虢婷婷，阮 穎*

(1作物種質資源創新與利用國家重點實驗室培育基地，長沙410128;2湖南農業大學生物科學與技術學院，長沙410128)

生物的多樣性，是通過基因表達來實現的。研究表明，基因表達的關鍵階段之一是轉錄的起始時期，其中RNA聚合酶與啟動子的相互作用至關重要。啟動子作為RNA聚合酶特異性識別和結合的DNA序列，是基因的組成部分之一，它控制著基因表達的起始時間和表達程度，對于基因的活動起著“開關”作用。啟動子的組成與結構影響它與RNA聚合酶的結合，從而影響基因表達的水平。因此，深入分析基因啟動子的功能結構與特性可以全面了解基因的功能。

SDG8(SET DOMAIN GROUP 8)基因編碼一種帶SET結構域的組蛋白甲基轉移酶［1］，SDG8(At1g77300)包含有15個外顯子，編碼的蛋白質含有1 759個氨基酸，是組蛋白甲基化修飾的調節基因［2，3］。SDG8 能催化組蛋白H3 上第36 位賴氨酸發生二、三甲基化［4］。研究表明，擬南芥(Arabidapsis thanilia)SDG8基因的突變可以引起擬南芥特定的表型改變，包括早花［5，6］、植物器官變小、增加莖的分枝［7，8］、類胡蘿卜素組成改變［9，10］、生殖能力降低［11］等。sdg8突變體的整體組蛋白二甲基化水平降低了［12，13］，使 FLC 基因位點的組蛋白二、三甲基化水平下降，FLC的表達下降，從而導致了擬南芥早花現象［14］。Shen等研究發現，擬南芥SDG8基因可以通過調節茉莉酸和/或乙烯信號轉導下游的基因來抵御真菌病原體，如突變體sdg8－1能夠促進死體營養型真菌病原體黑斑病、灰葡萄孢菌對植物的侵害［15］。

目前對SDG8基因的表達調控，特別是其啟動子功能區域結構如何還鮮有研究。為了進一步了解SDG8基因啟動子的結構特征，筆者在擬南芥SDG8基因轉錄起始位點上游分別克隆了－2 706 bp和－873 bp兩個片段，然后將兩個片段分別插到GUS報告基因前端［14］，并轉入模式植物擬南芥基因組中。在擬南芥的遺傳背景下剖析SDG8基因啟動子的功能結構，以為下一步研究基因的作用與功能打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥 Col－0，大腸桿菌，pBI121載體，抗生素，根癌農桿菌GV3101，GUS染色液，均由湖南農業大學植物表觀遺傳與代謝實驗室提供;pMD19－T載體，購自TaKaRa公司;DNA凝膠回收kit，購自安比奧公司;LongAmp Taq DNA Polymerase，購自Bio-Labs公司;PCR Mix，購自康為試劑公司;Trans DNA MarkerⅢ，100 bp plus，購自 Transgene公司。

1.2 方法

1.2.1 SDG8啟動子序列分析

利用PLACE數據庫分析啟動子基序。先通過PLACE數據庫對網上公布的SDG8基因上游的啟動子區域上的順式作用元件(基序)進行同源比對分析，再確定啟動子區域所包含基序的種類與數量。

1.2.2 表達載體的構建

從SDG8基因ATG往上游，到達另一個基因之間有2 860 bp，根據這段序列，設計引物:F－TCT GGGACAAGAATCAAAGGAGT，R － TCTAGACGTA ATGCTACCTGATTCAAA。PCR擴增產物經回收后，用HindⅢ酶切，得到4個不同長度的啟動子片段，2 793 bp，2 706 bp，2 433 bp 和873 bp。取其中長短不同的兩個片段(2 706 bp和873 bp)分別插入T載體，構建成SDG8啟動子片段與GUS基因相連的中間載體。然后再從中間載體上酶切取目的片段，插入到農桿菌轉化載體pBI121上，構建成雙元表達載體(圖1)。

圖1 表達載體構建圖Fig.1 Construction diagram of expression vector

1.2.3 浸花法轉化擬南芥及轉化子的篩選

分別用含有長、短啟動子片斷的農桿菌GV3101菌液浸泡待轉化的野生型擬南芥的花序，蓋上塑料蓋以保持濕度，移入20℃恒溫室避光培養，24 h后正常光照培養。約25 d左右，收獲種子。將浸花法轉化獲得的種子在黑暗條件下干燥10 d左右，表面消毒后，涂布在含有50 μg/mL卡那霉素的培養基平板上，每個直徑150 mm的平板鋪大約1 500顆種子。封口后置于4℃冷室春化2～3 d以打破休眠。移入20℃左右、光照強度為120～150 μmol/m2·t的擬南芥生長室培養，生長7 d后，觀察并統計。將存活的抗性苗轉移到蛭石中，通過分子檢測，最終確定轉基因植株。獲得的純合子轉基因植株SLP和SSP用于GUS基因的檢測。

1.2.4 GUS基因的表達檢測

分別將含長(SLP)、短啟動子(SSP)片段的轉基因擬南芥種子種到蛭石上，20 d后將植株洗凈，吸水紙吸干后放入裝有GUS染色液的細胞培養板中。置于抽真空儀中，兩次抽真空后，37℃染色4 h。70%乙醇脫色，直到綠色全部褪去。GUS染色液為100 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH=7.0)，內含0.5 mg/mL X －GluC，1%Triton X －100，1%DMSO 和10 mmol/L EDTA。脫色后，觀察并分析轉基因擬南芥SLP和SSP中GUS基因的表達情況。

2 結果和分析

2.1 SDG8啟動子基序分析

將SDG8啟動子序列在PLACE網站上比對分析，對SDG8啟動子2 706 bp和873 bp的片段的基序(motif)進行統計，結果顯示SDG8啟動子上包括已知的順式作用元件有98種。在整個啟動子區域，與創傷有關的元件、與光調控有關的元件和組織特異性表達相關元件以及基本功能元件分布其中。各種順式作用元件在－873 bp片段、－2 706 bp片段以及兩個片段之間的具體分布情況如表1。

表1 啟動子基序分布情況Table 1 The number of promoter motifs

由上表可知，與創傷有關元件WRKY71OS、與光調控有關元件、組織特異性表達相關元件GATABOX(GATA)以及基本功能元件 TATAbox(TATA)和CAATbox(CAAT)在長、短片段中均有分布。其中與創傷有關元件WRKY71OS在－873 bp片段中的分布密度高于－2 706 bp片段，其他元件分布相對均勻。通過進一步比較發現，有些基序僅存在于SDG8長啟動子的－873～－2 706 bp片段之間的區域，而短的啟動子－873 b p片段上則無分布， 如 AACACOREOSGLUB1，ABRELATERD1，MYB1AT等。

2.2 轉基因苗的檢測

收集野生型擬南芥浸花轉化后的種子，鋪在含有卡那霉素的培養基平板上。種子萌發后，觀察發現有的幼苗呈綠色，它們能夠正常生長，根系生長正常，子葉飽滿，葉片伸展;而有些幼苗則矮小發黃，其根相對較短，很少有側根，子葉發黃萎縮。隨后黃化苗逐漸變白，出現水化跡象，最后慢慢死亡。將抗性苗轉移到蛭石中，經PCR檢測，得到SDG8長啟動子轉基因陽性株系8株和短啟動子的轉基因株系11株，并收種子(圖2)。

圖2 抗性苗的篩選與檢測Fig.2 Screening and detection of anti－kanamycin seedings

2.3 轉基因植株的GUS表達檢測

在不作任何處理的前提下，野生型擬南芥Col－0作為陰性對照沒有檢測到GUS表達，帶有－873 bp啟動子片段的SSP植株觀察不到明顯的藍色，帶有－2 706 bp的SLP植株染色檢測有藍色(圖3)，即GUS基因可以正常表達，說明 －2 706 bp的SDG8啟動子片段能夠正常啟動SDG8基因的表達。而由于順式作用元件的缺乏，在－873 bp的SDG8啟動子作用下，檢測不到GUS基因明顯的表達，說明－873 bp不足以啟動SDG8基因的表達。根據長、短啟動子的基序比較分析，發現AACACOREOS GLUB1(AACAAAC)，ABRELATERD1(ACGTG)，MYB1AT(WAACCA)等基序僅分布于SDG8長啟動子的－873～－2 706 bp之間，短的啟動子－873 bp片段上則無分布。推測這些基序可能與SDG8啟動子某些特定功能相關，它們的缺乏導致短的啟動子的功能受到影響而不能正常啟動基因的表達。

圖3 帶有長短啟動子片段轉基因植株SLP和SSP的組織化學GUS染色Fig.3 GUS histochemical staining of SSP and SLP plants

3 小結與討論

啟動子控制著基因表達的起始和表達程度，對于基因的活動起著“開關”作用。為了對SDG8基因的功能結構組成有進一步的認識，本研究首次以SDG8的啟動子為研究對象，結合生物信息學的方法，運用啟動子缺失分析法，來分析不同片段大小的啟動子對于基因表達的啟動情況，初步確定SDG8啟動子的功能區域。基序分析統計結果表明，－2 706 bp的SDG8啟動子片段含有已知的與創傷有關的WRKY71OS基序、與光調控有關和組織特異性表達相關的GATABOX(GATA)基序，以及基本功能基序TATA－box和CAAT－box。但是，到目前為止并不知道那種基序是SDG8基因啟動所必須的。通過缺失分析發現，SDG8的－2 706 bp的長啟動子片段能啟動GUS基因的表達，而在短的－873 bp啟動子片段不能啟動GUS基因的表達。說明啟動SDG8的正常表達需要－873～－2 706 bp間的啟動子片段，即SDG8啟動子的核心啟動子(core promoter)部分存在于－873～－2 706 bp之間的區域。對長、短啟動子的基序比較分析，發現有些基序僅分布于SDG8長啟動子的－873～－2 706 bp之間的片段，如 AACACOREOSGLUB1(AACAAAC)，ABRE LATERD1(ACGTG)，MYB1AT(WAACCA)等。由于這些基序的缺乏，SDG8短的－873 bp啟動子不能正常啟動基因的表達。推測其中某些基序參與了啟動子啟動基因表達的功能，與核心啟動子的組成有關，而核心啟動子的長度、組成以及具體位置有待進一步分析。

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