輕度認(rèn)知障礙患者血小板中α、β－分泌酶基因表達(dá)水平及其臨床意義

何池忠 劉新通 王麗娟 張 雄 徐書雯 莫建偉 李東風(fēng)

輕度認(rèn)知障礙（mild cognitive impairment，MCI）是指介于正常老化和癡呆之間的一種過渡階段的認(rèn)知障礙，是老年性癡呆（Alzheimer disease，AD）發(fā)生的高危人群。在美國 MCI的發(fā)病率為9.9‰老年人，進(jìn)展為 AD的年發(fā)生率為6%～25%［1］，有學(xué)者認(rèn)為作為正常老化向AD發(fā)展的過渡狀態(tài)，MCI是AD藥物干預(yù)的最佳時(shí)機(jī)。但目前臨床上尚缺乏一種敏感的客觀的檢測(cè)指標(biāo)指導(dǎo)醫(yī)生對(duì)MCI進(jìn)行準(zhǔn)確的分型診斷及預(yù)后判定，一定程度上影響了AD早期干預(yù)的實(shí)施。α分泌酶（ADAM10）、β分泌酶（BACE1）是β淀粉樣前體蛋白（APP）的裂解酶，是影響Aβ產(chǎn)生的主要因素，可能在AD發(fā)病的早期機(jī)制中發(fā)揮重要作用［2］。本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（FQ－PCR）及ELISA技術(shù)檢測(cè)了MCI患者外周血中的ADAM10、BACE1基因表達(dá)水平及Aβ42濃度，探討ADAM10、BACE1在MCI分型診斷及預(yù)后判定中的作用和意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 來自廣東省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科及老年醫(yī)學(xué)研究所神經(jīng)內(nèi)科病房和門診2007年1月～2008年1月期間就診的MCI患者。符合Peterson等MCI診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］，診斷采用MCI國際工作組修訂的MCI診斷程序。納入標(biāo)準(zhǔn)包括主訴有記憶減退，病程≧3個(gè)月；有記憶減退的客觀證據(jù)；簡(jiǎn)易精神評(píng)定量表（MMSE）≥24分；臨床癡呆量表（CDR）0.5分；一般認(rèn)知功能與日常生活能力保持正常；無癡呆。排除標(biāo)準(zhǔn)包括明確的癡呆、明確的腦卒中病史及其他可引起腦功能障礙的軀體和精神疾病。共28例，男13例，女15例，年齡52～81歲，平均年齡（67.74±7.40）歲，受教育年限3～15年，平均（9.12±3.75）年。

對(duì)照組設(shè)AD組和正常老年組。AD病例來源同MCI組。AD的診斷采用CCMD—Ⅲ—R有關(guān)AD的診斷標(biāo)準(zhǔn)，共28例，男16例，女12例，年齡57～84歲，平均年齡（69.17±8.14）歲，受教育年限4～13年，平均（8.05±3.44）年。正常老年組來源于本院體檢中心的正常老人，共21例，男10例，女11例，年齡59～79歲，平均年齡（68.09±5.22）歲，受教育年限7～17年，平均年齡（10.65±2.84）年。MCI組和AD組、正常老年組的年齡、受教育年限比較無明顯差異（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 血小板標(biāo)本的采集 均抽晨靜脈血10 ml，2%EDTA抗凝，離心1 500 r／min×15 min，將上層的富血小板血漿轉(zhuǎn)移至塑料管中，離心3 500 r／min×5 min，分離上清并分別置于－20℃冰箱保存。

1.2.2 FQ－PCR 檢 測(cè) ADAM10、BACE1 mRNA表達(dá)水平

1.2.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 利用 Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，由Invitrogen公司合成。ADAM10：5＇－ACAGTGCAGTCCAAGTCAAG－3＇（forward），5＇ACACGTACACTCCTCTAAGC 3＇（reverse），片段長(zhǎng)244 bp。BACE1 5＇CATCCTTCCGCAGCAATACC3＇（forward），5＇TGCCGTCCTGAACTCATC GT3＇（reverse），片段長(zhǎng)208 bp，內(nèi)參照 GAPDH 5＇AGCCTCAAGATCATCAGC3＇（forward），5＇GAGT CCTTCCACGATACC3＇（reverse），片段長(zhǎng)度96 bp。

1.2.2.2 總 RNA提取和cDNA合成 采用 Trizol試劑盒（Invitrogen），按說明書提取血小板中的總RNA，1.2%瓊脂糖電泳鑒定血小板中總RNA；使用Prime Script TM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）合成cDNA，反應(yīng)體系共25μl，包括10×PCR buffer 2.5 μl，d NTP 1μl，dd H2O 18.15μl，Taq酶0.35μl，上游外引物（10 pmol／L）1μl，下游外引物（10 pmol／L）1μl，RNA模板：1μl。反應(yīng)條件為95℃3 min，94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，共30個(gè)循環(huán)，72℃10 min終止反應(yīng)，4℃保存。

1.2.2.3 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣本的FQ－PCR檢測(cè)將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸電泳，使用膠回收試劑盒（天根生化科技，北京）對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收純化；對(duì)回收純化的DNA測(cè)OD260及OD280，計(jì)算其濃度及純度，稀釋成106copies／ul作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的第一個(gè)梯度；再將各標(biāo)準(zhǔn)樣品以10倍梯度倍比稀釋，共做5個(gè)梯度；實(shí)時(shí)檢測(cè)儀（ABI 7300）上擴(kuò)增并檢測(cè)熒光；計(jì)算機(jī)自動(dòng)根據(jù)閾循環(huán)（Cycle threshold，Ct）值與對(duì)應(yīng)模板的拷貝數(shù)對(duì)數(shù)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；樣本的檢測(cè)按照SYBR Green熒光定量PCR試劑盒（Takara）說明書進(jìn)行；反應(yīng)體系共20μl，包括SYBR Green Real time PCR Master Mix 9μl，dd H2O 6μl，上游內(nèi)引物 F（10 pmol／μl）2μl，下游內(nèi)引物 R（10 pmol／μl）2μl，cDNA 產(chǎn)物1μl。反應(yīng)條件為95℃2 min，94℃15 s，60℃30 s，72℃35 s，共30個(gè)循環(huán)，在反應(yīng)的第二步94℃末讀取熒光值，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行融解曲線分析。

1.2.3 ELISA 檢測(cè)血漿中 Aβ42水平 ELISA 試劑盒由EHSY Lab（香港）贈(zèng)送，按說明書操作：常溫下解凍血漿，加蛋白酶抑制劑AEBSF（Sigma）至1 mmol／L，以防止Aβ降解。取出已包被的酶聯(lián)板（96孔），設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔，分別加標(biāo)準(zhǔn)品或樣品100μl，覆膜封存置室溫下2 h，棄液甩干，加Aβ42抗體反應(yīng)液100μl，覆膜封存置37℃下孵育2 h，棄液甩干，加二抗反應(yīng)液100μl，覆膜封存置室溫下2 h，棄液甩干，加底物及終止液，490 nm下讀取吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 目的基因的定量曲線與熔解曲線分析

在FQ－PCR反應(yīng)體系中每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一次熒光信號(hào)，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線，同時(shí)給出熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，即Ct值；Ct值與模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小；通過計(jì)算ΔCt值確定目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。ADAM10、BACE1的定量曲線見圖1、2。熔解曲線分析發(fā)現(xiàn)ADAM10、BACE1的PCR產(chǎn)物均呈較為銳利的單一峰（圖3、4），Tm分別為83.9℃和85.1℃，沒有其他雜峰出現(xiàn)。

圖1 ADAM10基因定量曲線

圖2 BACE1基因定量曲線

圖3 ADAM10基因熔解曲線

圖4 BACE1基因熔解曲線

2.2 血小板中ADAM10、BACE1基因的表達(dá)水平

每個(gè)樣品重復(fù)擴(kuò)增3次取均值，ΔCt值由計(jì)算機(jī)軟件自動(dòng)計(jì)算得出（表1）。AD、MCI組BACE1m RNA表達(dá)水平是正常老年組的4.51倍、2.22倍，有顯著性差異（F＝4.847，P＜0.05）。

表1 血小板中ADAM10、BACE1基因的表達(dá)水平（±s，ΔCt）

表1 血小板中ADAM10、BACE1基因的表達(dá)水平（±s，ΔCt）

注：與正常老年組比較，△P＜0.05；與 MCI組比較，▲P＜0.05

mRNA正常老年組 21 1.13±0.16 0.64±0.組別 n ADAM10 m RNA BACE1 22 AD組 28 211.61±0.11 2.89±0.20△▲MCI組 28 0.97±0.17 1.42±0.17△

2.3 血漿中Aβ42水平及相關(guān)性分析

MCI組、AD組及正常老年組的Aβ42水平中位數(shù)分別為250（90～680）ng／L、210（110～500）ng／L及160（75～630）ng／L，3組比較無明顯差異（F＝2.772，P＞0.05）。將 Aβ42值分別與 ADAM10ΔCt值、BACE1ΔCt值進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析顯示，Aβ42含量與ADAM10基因表達(dá)水平（r＝－0.1442，P＞0.05）及BACE1基因表達(dá)水平（r＝0.161 1，P＞0.05）均無關(guān)。

3 討 論

MCI不是一個(gè)疾病單元，而是一個(gè)異質(zhì)性臨床綜合征，其臨床轉(zhuǎn)歸并不相同。最近在歐洲完成的一項(xiàng)多中心研究發(fā)現(xiàn)750例MCI患者經(jīng)過至少2年的追蹤后，其中36%轉(zhuǎn)化為AD，8%轉(zhuǎn)化為血管性癡呆或其它類型的癡呆，52%病情保持穩(wěn)定不轉(zhuǎn)化為癡呆，4%逆轉(zhuǎn)成正常［4］。Peterson也認(rèn)為遺忘型MCI易轉(zhuǎn)化成AD，血管型MCI易轉(zhuǎn)化成血管性癡呆或其它類型的癡呆［3］。因此，臨床上迫切需要一種或幾種生物指標(biāo)能夠作為MCI臨床分型、轉(zhuǎn)歸判定的客觀依據(jù)，以指導(dǎo)開展癡呆的早期干預(yù)。近些年來的研究提示MCI腦脊液中乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶水平、總tau含量、磷酸化tau含量、總tau／Aβ42／40比值、磷酸化tau／Aβ42／40比值、Aβ42／Aβ40比值、apoE基因型等均可能成為臨床候選指標(biāo)［5，6］。也有研究者發(fā)現(xiàn) MCI患者血漿中的 Aβ42、Aβ40水平、Aβ42／Aβ40比值、血小板中的BACE1活性及APP異構(gòu)體比率等可能具有預(yù)后判定的價(jià)值，但由于重復(fù)性差或檢測(cè)復(fù)雜、費(fèi)用昂貴等原因這些指標(biāo)一直未能在臨床推廣［7，11，12］。本研究采用 FQ－PCR 技術(shù)檢測(cè)了MCI患者血小板中的ADAM10、BACE1的基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)AD、MCI患者BACE1mRNA表達(dá)水平是正常老人的4.51倍、2.22倍，且在AD中表達(dá)也高于MCI，這提示MCI血小板中BACE1mRNA的高表達(dá)可能具有臨床預(yù)測(cè)意義。這與目前的相關(guān)研究結(jié)論相一致［8，9］。Henrik等還發(fā)現(xiàn) MCI患者血漿中BACE1活性與β淀粉樣前體蛋白（APP）的代謝產(chǎn)物s APPα、s APPβ、Aβ42、Aβ40水平有關(guān)［10］。本研究用ELISA法檢測(cè)3組血漿中的Aβ42水平，沒有類似發(fā)現(xiàn)，可能與本研究樣品量少、診斷標(biāo)準(zhǔn)、檢測(cè)對(duì)象及方法不同有關(guān)。

在MCI向AD轉(zhuǎn)化的病程中一個(gè)主要的病理改變是患者的海馬、大腦皮質(zhì)及其他腦區(qū)出現(xiàn)大量Aβ淀粉樣沉積，而Aβ的形成與其前體蛋白APP的異常酶切加工有關(guān)。正常情況下APP經(jīng)α分泌酶（ADAM10）裂解產(chǎn)生可溶性s APPα及C83，可溶性APP對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有營養(yǎng)和保護(hù)作用，病理狀態(tài)下APP裂解由β，γ分泌酶介導(dǎo)，可產(chǎn)生大量致病性的Aβ42、Aβ40。BACE1是產(chǎn)生 Aβ的限速酶，其活性水平?jīng)Q定APP的代謝途徑。已經(jīng)證實(shí)BACE1是一類天冬酰氨蛋白酶，其基因定位于人類的11q23.2染色體，全長(zhǎng)2 526個(gè)堿基對(duì)，包含9個(gè)外顯子。BACE1表達(dá)同時(shí)受轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的調(diào)控，但轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控的機(jī)制目前并不十分清楚。研究表明BACE1是一種應(yīng)激蛋白，缺血［13］、缺氧［14］、腦損傷及能量剝奪［15］均可誘導(dǎo)BACE1mRNA表達(dá)上調(diào)及活性增加。O’Corner等的研究證實(shí)能量剝奪能夠激活轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)因子eIF2α磷酸化通道加快BACE1的轉(zhuǎn)錄效率，進(jìn)而引起B(yǎng)ACE1及Aβ的上調(diào)［16］。本研究中 AD、MCI患者的BACE1m RNA上調(diào)是否與慢性缺血、缺氧及能量障礙誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)因子eIF2α磷酸化有關(guān)，值得進(jìn)一步研究。Sandra等報(bào)道MCI患者腦脊液中BACE1活性與P－tau、T－tau水平高度相關(guān)，推測(cè)BACE1表達(dá)上調(diào)的原因可能與磷酸化tau蛋白的調(diào)節(jié)有關(guān)［17］。另外，作為產(chǎn)生Aβ的限速酶，BACE1上調(diào)不僅提供了MCI分型診斷的臨床線索，同時(shí)還為MCI早期藥物干預(yù)提供了靶點(diǎn)。α－分泌酶與AD的關(guān)系目前還不明晰，其活性需通過神經(jīng)遞質(zhì)受體系統(tǒng)激活，故在實(shí)際應(yīng)用中受到限制。

既往分析α、β－分泌酶基因表達(dá)水平所采用的方法如RT－PCR、Northern雜交以及RNA酶保護(hù)試驗(yàn)等，操作繁雜，敏感性低且易于污染。本研究采用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法則克服了上述缺點(diǎn)［18］，在PCR反應(yīng)過程中巧妙地將靶基因擴(kuò)增、雜交及光譜檢測(cè)技術(shù)結(jié)合在一起，PCR擴(kuò)增和終產(chǎn)物檢測(cè)全處于封閉的條件下進(jìn)行，可以對(duì)靶基因的表達(dá)水平進(jìn)行準(zhǔn)確定量，易于臨床推廣。

總之，本研究成功建立了檢測(cè)α、β－分泌酶基因表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，并發(fā)現(xiàn)AD、MCI患者血小板β－分泌酶基因表達(dá)水平高于正常老人，其意義在于一方面顯示了血小板β－分泌酶基因表達(dá)上調(diào)可能與MCI的轉(zhuǎn)歸（向AD轉(zhuǎn)化）有關(guān)，要求對(duì)于MCI患者應(yīng)盡早開展相關(guān)的酶學(xué)檢查，以實(shí)施早期藥物干預(yù)；另一方面提示β－分泌酶本身是一個(gè)值得干預(yù)的靶點(diǎn)。當(dāng)然尚需要更大樣本量以及動(dòng)態(tài)的追蹤研究進(jìn)一步證實(shí)。

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