P16 INK4a蛋白及人乳頭瘤病毒檢測對宮頸癌前病變的預測價值

金 艷，曹樹軍，楊道華，施華珍，錢金風

P16 INK4a蛋白及人乳頭瘤病毒檢測對宮頸癌前病變的預測價值

金 艷，曹樹軍，楊道華，施華珍，錢金風

目的 探討P16 INK4a蛋白及人乳頭瘤病毒 (HPV)DNA對檢測宮頸癌前病變的預測價值。方法 收集2008年11月—2011年10月在上海交通大學醫學院附屬第一人民醫院松江分院經細胞學篩查、陰道鏡活檢、組織病理學診斷為宮頸上皮內瘤變 (CIN)，并根據病變程度和患者意愿行宮頸錐切治療的705例患者作為研究對象。分析P16 INK4a蛋白及HPV DNA檢測對疾病的預測價值。結果 P16 INK4a蛋白陽性率在CINⅢ中高于HPV DNA陽性率(χ2=8.78，P＜0.05)，且P16 INK4a蛋白的陽性率與病變程度呈正相關 (r=0.258，P＜0.05)，而HPV病毒陽性率與病變程度呈負相關 (r=0.530，P＜0.05)。結論 P16 INK4a蛋白比HPV DNA對檢測CINⅢ具有更高的敏感性，所以HPV DNA聯合P16 INK4a蛋白檢測對CIN有更高的預測價值。

宮頸上皮內瘤樣病變;治療;人類乳頭病毒;P16 INK4a蛋白

宮頸細胞巴氏涂片 (PAP)及液基薄層細胞檢測 (TCT)目前已普遍應用于宮頸癌篩查，尤其PAP已普遍應用于發展中國家，且90%的宮頸癌是由人乳頭瘤病毒 (HPV)導致，如何更好地檢測HPV是多年來醫學界一直探討的問題。Miriam等［1］研究認為:單憑PAP檢查敏感度還不很高，應增加HPV DNA檢測，但HPV DNA感染的短暫性導致HPV DNA的診斷率也很低，而P16 INK4a蛋白在HPV感染后轉變中存在高表達，所以應結合P16 INK4a蛋白檢測增加其敏感度。在細胞學樣本中結合P16 INK4a蛋白組織學檢查增加診斷宮頸上皮內瘤變 (CIN)的敏感度。有研究顯示，宮頸細胞學檢查異常后接受陰道鏡檢查的人群中，免疫組織化學P16 INK4a蛋白在高級別病變中陽性率高［2］。本研究選擇2008—2011年在我院經陰道鏡檢查診斷為CIN同時又接受宮頸錐切 (LEEP)手術治療的患者，對其P16 INK4a蛋白及HPV DNA檢查結果進行探討，研究兩者對宮頸癌前病變的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2008年11月—2011年10月在上海交通大學醫學院附屬第一人民醫院松江分院經細胞學篩查、陰道鏡活檢、組織病理學診斷為CIN，并根據病變程度和患者意愿行LEEP治療的705例患者為研究對象;年齡20～69歲，平均(39.5±9.8)歲。其中CINⅠ:378例、CINⅡ:219例、CINⅢ:108例 (包括原位癌6例)。

1.2 方法

1.2.1 宮頸組織HPV DNA檢測 應用熒光定量PCR檢測儀對組織標本進行HPV DNA定性檢測，HPV DNA 16、18型檢測按照試劑盒說明書進行操作。檢測樣本Ct值＜38為陽性。

1.2.2 P16 INK4a蛋白檢測 取病理存檔臘塊組織標本，采用EnVision免疫組化二步法檢測組織標本中的P16 INK4a蛋白情況。試劑由上海長島生物技術有限公司提供，嚴格按照說明書要求由專業人員進行操作。

1.2.3 免疫組化結果判定 P16 INK4a蛋白陽性為胞核/胞質棕黃色顆粒著色。每張切片選取10個高倍鏡 (×400)視野，計數每500個細胞中陽性細胞數的均值，依據其陽性率和染色強度判斷結果。陰性:陽性細胞數＜10%或染色強度與背景顏色無明顯差異;陽性:陽性細胞數≥10%。

1.2.4 統計學方法 應用SPSS 11.5統計軟件進行統計學分析。HPV DNA感染陽性指標以檢出率表示，P16 INK4a蛋白陽性染色以陽性率表示，計數資料采用χ2檢驗，等級資料采用Spearm相關性分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 P16 INK4a蛋白陽性率在CINⅢ中高于HPV陽性率 (χ2=8.78，P＜0.05，見表1)，且P16 INK4a蛋白的陽性率隨著病變程度的加重而升高，呈正相關 (r=0.258，P＜0.05)，而HPV病毒陽性率隨著病變程度加重而下降，呈負相關 (r=－0.530，P＜0.05)。

2.2 CINⅢ病理符合率均較CINⅡ與CINⅠ高，差異有統計學意義 (χ2=7.58，χ2=5.87;均P＜0.05，見表2)。

表1 治療前各病變程度HPV DNA及P16 INK4a蛋白的陽性率比較Table 1 Comparison of positive rate of the lesion level HPV DNA and P16 INK4a before treatment

表2 HPV DNA及P16 INK4a蛋白檢測結果的病理符合率Table 2 Pathological coincedence rate of test results in HPV DNA and P16 INK4a

3 討論

3.1 PAP涂片對宮頸癌的預防有很大幫助，然而細胞學檢查也存在錯誤讀片率，從而降低了60%～70%的敏感度，假陰性結果對宮頸病變的漏診及治療造成很大影響［3］，高危型HPV DNA病毒篩查有利于減少假陰性率。雖然婦女生殖道感染高危型人乳頭狀瘤病毒 (hr－HPV DNA)較細胞學檢查具有更高敏感度，但因為它不能區別HPV DNA短暫性或轉換性感染，敏感度仍舊很低。結合生物標志物檢查會增加其敏感度，預防過度治療［4－5］。目前研究結果表明，P16 INK4a蛋白在高級別病變中存在高敏感度，克服了由于PAP檢測缺點及HPV DNA檢測作為HPV DNA短暫性及轉變性。Szarewski等［6］通過分析以往資料顯示，P16 INK4a蛋白對感染過HPV DNA的轉換中CIN具有更高敏高度，且高達81%～100%。

3.2 P16 INK4a蛋白的表達與宮頸病變密切相關 采用免疫組化法檢測P16 INK4a蛋白可廣泛運用于細胞學檢查，同時進一步區分未明確意義的不典型鱗形細胞 (ASCUS)中具有病變的細胞，Nieh等［7］同樣依靠P16 INK4a蛋白在非典型腺細胞 (AGC)中的表達發現更加嚴重的病變從而得出相同的結論。P16 INK4a蛋白可作為細胞學診斷的一個生物學標記，這與Liu等［8］的研究結論一致，認為P16 INK4a蛋白蛋白細胞學中的表達能夠增加診斷的敏感性和特異性。P16 INK4a蛋白基因是迄今發現的第1個直接作用于細胞周期、抑制細胞分裂的基因。P16 INK4a蛋白基因的缺失、突變和甲基化存在于多種人腫瘤細胞，提示其與腫瘤的發生、發展密切相關［9］。在宮頸癌的研究中，P16 INK4a蛋白基因在宮頸癌中的表達與其抑癌基因形象并不相符，P16 INK4a蛋白蛋白在宮頸癌中呈高表達［3－4］。目前P16 INK4a蛋白與宮頸癌關系的研究，已成為近年來宮頸癌的研究熱點。P16 INK4a蛋白在宮頸上皮細胞惡性轉化前已出現，并隨著宮頸癌前病變級別進展而增加。有研究認為，P16 INK4a蛋白在HPV DNA感染陽性的子宮頸鱗癌中有很高的陽性表達率，可以誘導P16 INK4a蛋白的過度表達并使其具有永生性的特點，P16 INK4a蛋白過度表達可能直接或間接由HPV DNA病毒編碼蛋白E6和E7所誘導，它們可以與P53和PRB結合并使其活性下降最終導致宮頸覆蓋上皮發生惡變［7］，P16 INK4a蛋白已經被推算作為評價CIN及宮頸癌一個可靠的標志［10］。

3.3 當前在宮頸病變的治療中，一個誤區是將CINⅠ均認為是癌前病變，進行積極治療。不少學者認為2002年制定的美國陰道鏡和宮頸病理學會 (ASCCP)方案存在對CINⅠ的過度治療。近年來大量臨床資料證實，CIN未經治療即有較高的自然消退率，CINⅠ60%～90%在2年內逆轉，而且癌變的幾率極低［8，11］。因此，對于無癥狀、細胞學為ASCUS和低度鱗狀上皮內病變 (LSIL)，即使轉化區不可見，也不用頸管刮宮，也不必錐切或LEEP，建議嚴格隨訪。CINⅠ患者可于隨訪觀察，CINⅡ患者觀察的可行性可作為今后研究方向，避免患者進行不必要的治療，尤其是有生育要求的患者，HPV DNA結合P16 INK4a蛋白檢測對CIN診斷及治療很大幫助。

3.4 陰道鏡作為隨訪檢查的主要手段發現，結合HPV DNA及P16 INK4a蛋白檢查，能更好的預測宮頸癌前病變及治療后的隨訪［12］，在今后的治療預測和觀察中，可通過細胞學檢查同時將P16 INK4a蛋白檢測結合陰道鏡作為重要的檢測指標，可避免不必要的創傷性檢查及治療。

綜上，CINⅠ采取LEEP手術存在過度治療傾向;CINⅡ中發現病理升級率低，也可進行隨訪觀察，作為今后研究方向;CINⅢ行宮頸錐切是目前主要治療手段。HPV DNA聯合P16 INK4a蛋白檢查能更好的預測宮頸內瘤樣病變。

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2 del Pinoa M，Rodriguez－ Carunchiob L，Alonsoa I，et al.Clinical，colposcopic and pathological characteristics of cervical and vaginal highgrade lesions negative for HPV DNA by Hybrid Capture［J］.Gynecol Oncol，2011，122(3):515 －520.

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5 Reuschenbach M，Clad A，von Knebel Doeberitz C，et al.Performance of P16 INK4a－cytology，HPV DNA mRNA，and HPV DNA testing to identify high grade cervical dysplasia in women with abnormal screening results［J］.Gynecologic oncology，2010，119(1):98 －105.

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11 曹樹軍，錢金風，朱凌，等.宮頸錐切術對陰道鏡檢查臨床應用的再評價［J］.中國婦幼保健，2008，23(17):749－753.

12 Wen JZ，Ying L，Hua LF，et al.The value of P16 INK4a expression by fluorescence in situ hubridization in triage for high risk HPV DNA positive in cervial cancer screening ［J］.Gynecologic Oncology，2011，120(3):84－88.

Value of Immunocytochemical Staining of P16 INK4a Protein Combined with Human Papillomavirus Test for the Detec-tion of Cervical Intraepithelial Neoplasia

JIN Yan，CAO Shu－jun，YANG Dao－hua，et al.Department of Obstetrics and Gynecology，Songjiang Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medcine，Shanghai 201600，China

ObjectiveTo evaluate the value of immunocytochemical staining of P16 INK4a protein combined with human papillomavirus(HPV)test for detecting cervical intraepithelial neoplasia(CIN).Methods Totally 705 patients with pathologically confirmed CIN in our hospital from November 2008 to October 2011 were enrolled in this study.We made a retrospective study of the clinical and pathological data by immunocytochemical staining of P16 INK4a protein combined with HPV test.ResultsThe sensitivity of the positive rate of P16 INK4a in high－grade CIN was significantly higher than that of HPV DNA test(χ2=20.642，P ＜0.05).The positive rate of P16 INK4a protein staining was positively correlated with the pathologic degree of lesions(χ2=38.432，P ＜0.05)，while the positive rate of P16 INK4a test was positively correlated with the pathologic degree(r=0.2580，P＜0.05)the positive rate of HPV DNA test was negatively correlated with the pathologic degree(r=－0.530，P＜0.05).ConclusionThe immunocytochemical staining of p16 INK4a protein has a higher sensitivity than HPV DNA test in detecting high grade CIN，and therefore it，when combined with HPV DNA test，has a high predictive value for CIN.

Cervical intraepithelial neoplasia;Treatment;Human papilloma virus(HPV DNA);P16 INK4a immunostaining protein

R 711.74

A

1007－9572(2012)10－3368－03

10.3969/j.issn.1007－9572.2012.10.054

上海市松江區醫學領先專業建設資助項目 (05－Ⅰ－04);上海市松江區科技攻關項目

201600上海市，上海交通大學醫學院附屬第一人民醫院松江分院婦產科 (金艷，曹樹軍，施華珍，錢金風)，病理科(楊道華)

曹樹軍，201600上海市，上海交通大學醫學院附屬第一人民醫院松江分院婦產科;E－mail:shujun－cao@163.com

2012－02－23;

2012－09－10)

(本文編輯:李晨)