臭豆堿在大鼠體內的毒代動力學和組織分布

達林其木格 內蒙古呼和浩特職業學院 010050

李培鋒 內蒙古農業大學動物醫學與科學院 010018

關 紅 內蒙古農業大學動物醫學與科學院 010018

臭豆堿（Anagyrine，Ana）為黃色油狀液體，難溶于石油醚，可溶于乙醚和苯，易溶于氯仿、乙醇和水。為順式并聯的喹諾里西啶，分子式為C15H20N2O，是黃華堿的立體異構體[1]。在黃花棘豆（Oxytropis ochrocephala Bunge）、甘肅棘豆（Oxytropis kansuensis）和小花棘豆（Oxytropis glabra）等多種毒草以及披針葉黃華和苦參中均含有臭豆堿[2、3]，其中在小花棘豆中含量較高，是主要有毒生物堿之一[4]。這些毒草廣泛分布在中國西北地區的天然牧場，對當地畜牧業造成了非常嚴重的危害。國外學者研究證明，臭豆堿對較高等的動物有致畸作用，如引起家畜畸形、腭裂、腿和脊柱變形等，亦可導致胎兒流產。此外，臭豆堿還具有促進分娩、治療痛經等作用[5～7]。20世紀70年代末日本學者太田長世等曾用氨基柱成功地分離和測定了中藥苦參中的臭豆堿含量[8]。筆者創立了臭豆堿在大鼠血漿中的用反相離子對高效液相色譜法[9]，此法亦適用于檢測臭豆堿在大鼠肝、腎、腦組中的濃度，以探明臭豆堿在動物體內毒動學及組織分布情況提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級Wistar大鼠，體重190±10g，雌雄各半。

1.2 藥品與試劑

臭豆堿粗提物（寧夏測量中心提供，臭豆堿含量 37.87%）。

臭豆堿純品 （對臭豆堿粗提物經過分離純化、重結晶所得，用HPLC面積歸一化法測定臭豆堿，含量不低于99%）十二烷基磺酸鈉（SDS）為HPLC專用，磷酸、三乙胺（重蒸）、三氯甲烷、異丙醇、氨水為分析純，乙腈為色譜純，水為附院自制重蒸餾水。臭豆堿純品儲備液（1mg/mL）：精密稱取臭豆堿純品25mg溶于25.0mL甲醇中，置-4℃冰箱內保存。

1.3 儀器

日本島津LC-10A高效液相色譜系統，包括LC-10AT泵、SPD-10A此外檢測器、CTO-10A柱溫箱、SCL-10A系統控制器、CR-7Ae數據處理器、DUG-12A在線脫氣泵，FZQ-2型旋渦混合器，LN-9527-01 型高速離心機 （10000r/min），SFO-01B型電熱恒溫鼓風干燥箱。

1.4 分組給藥與采樣

Wistar大鼠105只，隨機分成15組,每組7只，按6.82mg/kgobow單劑量灌胃臭豆堿。灌胃前夜禁食 12 小時，自由飲水，按時序（0.5、1.5、2.5、5、10、20、40、60、90、120、240、360、480、600、720min）分別采集各組大鼠的血漿、肝臟、腎臟和腦組織。

1.5 血樣處理與測定

精密吸取血漿樣品1.0mL，置10mL試管中，精確加入25%氨水200μL充分混勻，加3.0mL三氯甲烷旋渦混合提取5min，離心(5000r/min)5min,分取有機相，在65℃水浴中空氣吹干，將殘留物準確用 500μL 甲醇溶解,離心 (10000r·min-1)2min，取25μL進樣分析，空白血漿及血漿樣品色譜圖見圖1。

1.6 組織樣品處理

稱取腎組織約1g,精密稱定,精確加入25%氨水50uL，再加3.0mL三氯甲烷,用組織勻漿機搗碎3min,有機相全部轉入10mL離心管(5000r/min)15min,分取有機相,在65℃烘箱中空氣吹干,將殘留物準確用500uL甲醇溶解,離心(10000r/min)2min,取25uL進樣分析，空白組織及組織樣品色譜圖見圖1。

1.7 色譜條件

色譜柱為大連產 HYP-ODS柱 （200mm×4.6mm）,柱溫30℃；流動相由水相-異丙醇-乙腈（150：15：20體積比）組成。水相部分每 1000mL 中含SDS 0.5g,三乙胺3.5mL,85%磷酸2mL(用三乙胺調至PH 3.0)；流速 1.0mL.min-1紫外檢測波長309nm。

1.8 血漿標準曲線制備

精密吸取大鼠空白血漿1.0mL,共 7份，置7支10 mL離心管中，定量加入臭豆堿純品儲備液，使其濃度分別為 60、120、250、500、1000、1500、2000μg·L-1，按“1.5”項下方法操作，以被測物峰面積Y對濃度X(μg·L-1)進行線性回歸得回歸方程：Y=166.76x-1369.3 r=0.9993以信噪比 S/N=3為標準，本方法的最低檢測濃度為10μg·L-1。

1.9 組織體外標準曲線的制備

用臭豆堿儲備液分別配成 50、120、250、500、1000ng/mL 和 1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000ng/mL兩種濃度梯度。以被測物峰面積Y對濃度X(μg/L)進行線性回歸得回歸方程分別為：低濃度為Y=86.458X+286.6，R2=0.9999； 高濃度為 ：Y=85.719X+21686 R2=0.9988。

2 結果

2.1 臭豆堿的色譜行為

在上述的色譜條件下,基線走動平穩。空白血漿、肝﹑腎﹑腦組織雜峰少,對臭豆堿峰無干擾。樣品中臭豆堿與前面未知物峰達到了基線分離。經HPLC分析后，所得結果見表1。

2.2 臭豆堿的藥時曲線圖

大鼠灌服臭豆堿6.82mg/kg后,血、肝、腦和腎組織中的濃度見表1；平均毒物濃度-時間曲線見圖2。

表1：大鼠灌服臭豆堿6.82mg/kg后血漿、肝、腦和腎組織中的濃度(n=7,±SD)

表1：大鼠灌服臭豆堿6.82mg/kg后血漿、肝、腦和腎組織中的濃度(n=7,±SD)

2.3 動學參藥數

經DAS ver1.0藥動學軟件處理,選定血漿﹑肝﹑腎和腦組織液的最佳藥代動學模型為一級吸收一室開放模型，主要參數見表2。

表2：口服臭豆堿在大鼠血漿、肝、腎和腦組織內的藥代動力學參數比較

3 討論

（1）血漿與肝、腎、腦組織藥物濃度經DAS ver1.0藥代動力學軟件處理數據，臭豆堿在大鼠體內與組織的動力學特性均可用一級吸收的一室開放模式去擬合，根據所獲得的毒代動力學參數可知，吸收半衰期長短順序為：腦組織﹥腎臟﹥血漿﹥肝臟，其中在肝組織中吸收半衰期為0，這表明臭豆堿進入胃內后可被迅速吸收，分布到肝、腎、腦組織；消除半衰期均在2.4小時內，其長短順序為：腦組織﹥血漿﹥肝臟﹥腎臟，而其差相異構體-黃華堿的的消除半衰期則為121.3小時 [10]；達峰時間長短順序為：腎臟﹥血漿﹥腦組織﹥肝臟，其中在肝臟的達峰時間僅為2.5min；峰濃度大小順序為：腎臟﹥肝臟﹥腦組織﹥血漿。說明臭豆堿灌服后具有吸收快、分布迅速、消除快、蓄積時間短的特點。

（2）臭豆堿的肝腎平均濃度是腦組織平均濃度的10倍和13倍。臭豆堿的血液濃度很低，其平均峰濃度不到1mg/L，這和黃華堿的結果基本一致[10]。胃中的食糜對臭豆堿的吸收有很大的影響，給藥后完全禁食禁水狀態下8小時后血液中基本測不到臭豆堿，但不禁食狀態下12小時后血液濃度仍然還能測出。本實驗是完全禁食禁水狀態下進行的。

（3）臭豆堿是小花棘豆的主要有毒生物堿之一。小花棘豆中毒表現為以廣泛的空泡變性為主的全身性退行性變化，其中肝臟首先受到損傷，而腎臟、腦組織的損傷遲于肝臟。臭豆堿在肝、腎、腦組織均有很高的分布，且平均濃度比血漿高，臭豆堿的這一毒代動力及組織分布特點與小花棘豆中毒后的損傷規律是一致的。

[1]孟協中.胡向群等，黃花棘豆毒性生物堿的鑒定.寧夏大學學報（自然科學版），1994，15（2）：67～70.

[2]孟協中.胡向群等，寧夏兩種有毒棘豆中毒性成分的研究.寧夏農林科技，1994,2:37-40.

[3]孟協中.張如明甘肅棘豆中有毒生物堿的研究，草業學報，4(1):6-8

[4]史志誠.中國草地重要有毒植物，中國農業出版社，1996，45～65.

[5]Makal W,]Keller W J.Alkaloid distribution in two species of bupinus in central British Columbia.Phytochemisty.1994,36:4,883-885.

[6] Panter K E,GardnerD R.Comparisonof toxic and teratogenic effects of lupinus formaosusm L,arbustus and L.cauclatus in goats.Journal of Natural toxins,1994,3:2,83-93.

[7] Btez J M,Andrze Jewski D.Gas chromatographic determination of toxic quinolizidine alkaloid in blue cohosh Caulophyllum thalictroides.(L)Michx phytochemical-Analysis.1998,9:5,232-236

[8]Nagayo Ota,YoshikiMino.Pharmacognostical Studies on the Chinese Crude Drug"Sophorae Radix" (I) High-Speed Liquid Chromatographic Studies on the Alkaloid Constituents of "Sophorae Radix".Shoyakugaku Zasshi.1979,33(3),140-145.

[9]李培鋒、達林其木格等，臭豆堿在大鼠體內的毒代動力學研究，毒理學雜志，2008,22（3）：204-206.

[10]李守軍、李祚煌、楊桂云.小花棘豆中[3H]黃花堿的毒代動力學及體內分布，動物毒物學，1991，（6卷）1 期：3-7.