江西柑橘主產(chǎn)區(qū)柑橘衰退病毒分離株組群分析

易 龍， 賴曉樺， 盧占軍1，， 鐘八蓮

（1.贛南師范學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，贛州 341000；2.江西省臍橙工程技術(shù)研究中心，贛州 341000）

柑橘衰退病是由柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV）引起的柑橘上極具經(jīng)濟(jì)重要性的病害之一，嚴(yán)重影響著柑橘的產(chǎn)量和品質(zhì)，對(duì)柑橘生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的危害。CTV主要通過(guò)蚜蟲(chóng)和帶病接穗進(jìn)行傳播，目前已經(jīng)毀滅了超過(guò)1億株的柑橘，并仍然嚴(yán)重威脅著世界上以酸橙作砧木的柑橘產(chǎn)區(qū)和對(duì)莖陷點(diǎn)型CTV敏感的柚類、葡萄柚和某些甜橙的安全［1]。

由于CTV在田間通過(guò)蚜蟲(chóng)傳播，國(guó)外的防治經(jīng)驗(yàn)表明，在CTV強(qiáng)毒株和有效傳媒橘蚜存在的種植區(qū)域，弱毒株交叉保護(hù)是最有效的防治措施［2－3]，而對(duì)其分離株的分析是應(yīng)用該技術(shù)的基礎(chǔ)［4]。江西贛南憑借其得天獨(dú)厚的適宜臍橙生長(zhǎng)的環(huán)境條件，已成為種植面積世界第一的臍橙主產(chǎn)區(qū)［5]。在前期調(diào)查中發(fā)現(xiàn)贛南臍橙上CTV感染率達(dá)44.9%［6]，給生產(chǎn)帶來(lái)了嚴(yán)重的威脅。目前針對(duì)江西贛南臍橙產(chǎn)區(qū)柑橘衰退病毒分離株的構(gòu)成情況尚缺乏全面調(diào)查，因此有必要對(duì)產(chǎn)區(qū)CTV分離株進(jìn)行致病性鑒定，明確其組群構(gòu)成情況，尋找潛在的弱毒分離株，為今后江西柑橘衰退病的深入研究以及篩選弱毒株進(jìn)行交叉保護(hù)防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

分別采自江西信豐、安遠(yuǎn)、尋烏、龍南、崇義等柑橘主產(chǎn)區(qū)，經(jīng)直接組織點(diǎn)免疫法（DTBIA）［7]檢測(cè)呈陽(yáng)性的209份樣品作為供試樣品。

1.2 樣品總核酸提取

按照周常勇等［8]的方法提取樣品總核酸。

1.3 外殼蛋白（CP）基因的擴(kuò)增

參照Gillings等［9]的方法，由上海生工生物工程公司合成CTV外殼蛋白（CP）基因的特異性引物CP1（5′－ATGGACGACGAAACAAAG－3′）、CP3（5′－TCA－ACGTGTGTTGAATTT－3′），在Bio－Rad公司生產(chǎn)的 PTC－200型基因擴(kuò)增儀進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT－PCR）。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，用GoldView I染色后在Gel DocTMXR型凝膠成像系統(tǒng)上觀測(cè)。

1.4 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）分析

將PCR產(chǎn)物與限制性內(nèi)切酶HinfⅠ（TaKaRa產(chǎn)品）反應(yīng)體系相混合，37℃酶切1h，用3%超純瓊脂糖凝膠電泳后檢測(cè)酶切圖譜［9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 CTV CP基因的擴(kuò)增

對(duì)樣品抽提的總核酸用CTV CP基因特異性引物進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，209份樣品及陽(yáng)性對(duì)照均能擴(kuò)增出一個(gè)大小約672bp的DNA條帶（圖1），與已知CTV的CP基因大小相一致，陰性對(duì)照和水對(duì)照均不能擴(kuò)增出該產(chǎn)物。

圖1 江西柑橘產(chǎn)區(qū)部分柑橘樣品CTV的RT－PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 CP／HinfⅠRFLP分析

根據(jù)Gillings等［9]的CTVCP／HinfⅠRFLP組群劃分標(biāo)準(zhǔn)，本試驗(yàn)中209份樣品的CP／HinfⅠ酶切結(jié)果中182份樣品表現(xiàn)出單一CP／HinfⅠRFLP譜型，占鑒定樣品總數(shù)的87.1%，表明在本次試驗(yàn)中檢測(cè)的江西柑橘樣品以CTV單一組群感染為主，主要分屬于CP／HinfⅠRFLP第3和第1組群（圖2）。

圖2 江西柑橘產(chǎn)區(qū)部分柑橘樣品CTV的CP／Hinf I RFLP酶切圖譜

進(jìn)一步分析表明，在209份樣品中單一RFLP組群3、1分別占樣品總數(shù)的55.5%、26.8%，說(shuō)明江西柑橘CTV分離株主要由CP／HinfⅠRFLP第3和第1組群構(gòu)成；同時(shí)有27個(gè)樣品含有多個(gè)RFLP組群，占樣品總數(shù)的12.9%，表明田間存在不同CTV分離株混合侵染的現(xiàn)象，其中以組群1和3混合發(fā)生為主，所有樣品中未檢出RFLP第2和第7組群的CTV分離株（表1）。檢測(cè)樣品中有1個(gè)分離株為第4組群，5個(gè)分離株為第5組群，初步判斷為潛在的弱毒株，有待進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。

表1 江西柑橘產(chǎn)區(qū)柑橘衰退病毒CP／HinfⅠRFLP組群構(gòu)成情況

3 討論

CTV為一種正義單鏈RNA病毒，具有較高的變異幾率，常由多個(gè)不同的分離株所組成［10]，給病害的鑒定和防治帶來(lái)了一定的難度，在生產(chǎn)上往往需要準(zhǔn)確、快速的方法對(duì)CTV的各個(gè)分離株進(jìn)行鑒定和區(qū)別。CTV被分成具有不同生物學(xué)特性的7個(gè)CP／HinfⅠRFLP組群，其中第4組群和第5組群的分離株在指示植物上呈弱反應(yīng)，從中可以篩選具有潛在交叉保護(hù)作用的弱毒株；而其余組群中的分離株在指示植物表現(xiàn)出強(qiáng)致病性［9]。據(jù)此，國(guó)內(nèi)外廣泛運(yùn)用CP／HinfⅠRFLP技術(shù)對(duì)CTV的CP基因進(jìn)行限制性酶切，來(lái)快速準(zhǔn)確地對(duì)CTV分離株進(jìn)行致病性鑒定［9，11－13]。

本研究結(jié)果表明在江西柑橘主產(chǎn)區(qū)CTV的CP／HinfⅠRFLP組群構(gòu)成以第3、1組群為主，其余組群發(fā)生較少，研究結(jié)果與Xu等［11]分析我國(guó)福建、重慶甜橙產(chǎn)區(qū)113個(gè)CTV分離株主要以CP／HinfⅠRFLP第3和1組群構(gòu)成結(jié)果相類似，但其研究結(jié)果田間以混合組群發(fā)生為主，而本研究中江西柑橘主產(chǎn)區(qū)CTV以單一組群構(gòu)成為主，可能是江西贛南大部分柑橘園中的樹(shù)齡不長(zhǎng)，CTV感染的時(shí)間短，變異較少，加上果園中傳媒昆蟲(chóng)少等原因而導(dǎo)致混合感染發(fā)生率低，存在差異的具體原因還有待進(jìn)一步分析。另外本研究中分析的樣品RFLP組群圖譜總體符合Gillings［9]建立的CTV組群劃分標(biāo)準(zhǔn)，在今后江西柑橘產(chǎn)區(qū)田間大量樣品CTV分離株的快速鑒定中可運(yùn)用此技術(shù)。

［1]Moreno P，Ambrós S，Albiach－MartíM R，et al.Citrus tristeza virus：apathogen that changed the course of the citrus industry［J].Molecular Plant Pathology，2008，9（2）：251－268.

［2]Lin Y J，Rundell P A，Powell C A.In situ immunoassay（ISIA）of field grapefruit trees inoculated with mild isolates of Citrus tristeza virus indicates mixed infections with severe isolates［J].Plant Disease，2002，86：458－461.

［3]Williams A P，Mathews D M，Heick J A，et al.Segregation of sweet orange stem pitting types and stunting factors in subcultures from the severe SY568strain of Citrus tristeza virus［C]∥Duran－Vila N，Milne R G，da Graca J V.Proceedings of the 15thConference of the International Organization of Citrus Virologists.Riverside：IOCV，2002：21－30.

［4]Sambade A，Ambrós S，López C，et al.Preferential accumulation of severe variants of Citrus tristeza virus in plants co－inoculated with mild and severe variants［J].Archives of Virology，2007，152（6）：1115－1126.

［5]匡兵，楊曉伶，陳根生.贛南臍橙產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)分析［J].農(nóng)業(yè)工程技術(shù)（農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)），2010（3）：34－37.

［6]陶珍珍，易龍，盧占軍，等.贛南臍橙主產(chǎn)區(qū)柑橘衰退病發(fā)病率調(diào)查研究［J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27（16）：297－300.

［7]Garnesy S M，Permar T A，Camber M，et al.Direct tissue blot immunoassay（DTBIA）for diction of Citrus tristeza virus（CTV）［C]∥Moreno P，da Graca J V，Timmer L W.Proceeding 12thconference of the international organization of citrus virus.Riverside：IOCV，1993：39－50.

［8]周常勇，Hailstones D L，Connor R，等.一種微量、快速抽提柑橘衰退病毒（CTV）核酸應(yīng)用于RT－PCR擴(kuò)增的方法［J].福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，30（S1）：200.

［9]Gillings M R，Broadbent P，Indsto J，et al.Characterization of isolates and strains of Citrus tristeza closterovirus using restriction analysis of the coat protein gene amplified by the polymerase chain reaction［J].Journal of Virological Methods，1993，44：305－317.

［10]Broadent P，Brlansky R H，Indsto J.Biological characterization of Australian isolates of Citrus tristeza virus and separation of subisolates by single aphid transmissions［J].Plant Disease，1996，80（3）：329－333.

［11]Xu X F，Zhou C Y，Song Z，et al.Preliminary studies on CPG／Hinf I RFLP groups of citrus tristeza virus infected sweet oranges in China［J].Agricultural Sciences in China，2006，5：39－44.

［12]宋震，徐小峰，楊方云，等.柑橘衰退病毒柚分離株的p25／HinfⅠRFLP分析［J].植物保護(hù)，2005，31（4）：28－31.

［13]周彥，王雪峰，唐科志，等.重慶地區(qū)柑桔衰退病毒組群分析［J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，26（4）：420－422，451.