轉(zhuǎn)sck／cry1Ac基因稻谷對(duì)米蛾幼蟲(chóng)解毒酶系的影響

肖海兵， 劉映紅， 劉 旭， 肖珍珍， 楊 璐， 龍 潔

（西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院昆蟲(chóng)學(xué)及害蟲(chóng)控制工程重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400716）

稻谷儲(chǔ)藏是水稻生產(chǎn)中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。由于受到倉(cāng)儲(chǔ)條件和防蟲(chóng)技術(shù)的限制，每年在北方地區(qū)因蟲(chóng)害造成的儲(chǔ)糧損失為3%～5%，南方地區(qū)為6%～8%，損失糧食200億～300億kg［1]。轉(zhuǎn)Bt基因稻谷能有效降低儲(chǔ)糧損率，儲(chǔ)藏17個(gè)月后，Bt稻谷的蟲(chóng)蝕率顯著降低，達(dá)0.70%～1.20%［2]。但是儲(chǔ)藏期的轉(zhuǎn)Bt基因稻谷‘KMD1’和‘KMD2’的Bt毒蛋白含量分別為1.34μg／g和1.42μg／g，且較為穩(wěn)定，不容易被降解［3－4]，長(zhǎng)期接觸轉(zhuǎn)基因水稻的倉(cāng)儲(chǔ)害蟲(chóng)會(huì)通過(guò)解毒代謝增加對(duì)轉(zhuǎn)基因稻谷的適應(yīng)性。米蛾（Corcyra cephalonica Staint）屬鱗翅目，螟蛾科，蠟螟亞科，是重要的倉(cāng)庫(kù)害蟲(chóng)，主要為害大米、稻谷和多種倉(cāng)儲(chǔ)物［5]。研究轉(zhuǎn)Bt基因稻谷對(duì)米蛾等鱗翅目靶標(biāo)儲(chǔ)糧害蟲(chóng)的影響具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和經(jīng)濟(jì)意義。

Bt殺蟲(chóng)蛋白受靶標(biāo)害蟲(chóng)中腸蛋白酶水解而被激活，經(jīng)激活的Bt毒蛋白與中腸刷狀緣膜囊泡（BBMV）受體結(jié)合，最終導(dǎo)致腸道內(nèi)壁的病變而引起死亡［6]。而昆蟲(chóng)解毒酶主要是以各種酯酶為代表，對(duì)分解外源毒物、維持正常生理代謝起重要作用［7]。Bt毒蛋白顯著影響棉鈴蟲(chóng)和玉米螟的解毒酶酶活，可能發(fā)生代謝抗性［8－9]。為了拓寬轉(zhuǎn)基因水稻的抗蟲(chóng)譜和延緩害蟲(chóng)抗性風(fēng)險(xiǎn)，我國(guó)將豇豆胰白酶抑制劑（CpTI）基因修飾后（命名為sck基因）與Bt－cry1Ac基因構(gòu)成雙價(jià)抗蟲(chóng)融合基因并成功地轉(zhuǎn)入‘明恢’系列雜交水稻中［10]，并對(duì)二化螟幼蟲(chóng)具有高致死率［11]。轉(zhuǎn)sck／cry1Ac基因稻谷對(duì)儲(chǔ)糧害蟲(chóng)生化特性的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)研究解毒酶和酯酶同工酶的變化，可在生化水平上分析米蛾對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因稻谷產(chǎn)生抗性的原因［12]，為揭示轉(zhuǎn)Bt基因稻谷對(duì)米蛾的生理生化作用機(jī)制和代謝抗性機(jī)理提供理論依據(jù)，更有利于實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)sck／cry1Ac基因水稻的持續(xù)利用。

1 材料與方法

1.1 供試稻谷及Bt毒蛋白含量

試驗(yàn)用水稻稻谷為福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供的儲(chǔ)藏6個(gè)月的轉(zhuǎn)sck／cry1Ac（sck基因?yàn)樾揎椀腃pTI基因）雙價(jià)抗蟲(chóng)基因水稻稻谷‘Ⅱ優(yōu)MS67’，實(shí)驗(yàn)室用ELISA方法測(cè)定sck／cry1Ac中Cry1Ac毒蛋白含量為1.375μg／g。非轉(zhuǎn)基因親本‘Ⅱ優(yōu)明86’為對(duì)照品種。

谷粒前處理：稻谷經(jīng)水洗除空殼，烘干（45±2.5）℃，12h，置于－20℃冰箱中殺蟲(chóng)處理2d，置于盛有飽和食鹽水的干燥器中一個(gè)月，調(diào)節(jié)稻谷含水量至20%左右，試驗(yàn)前粉碎。

1.2 供試蟲(chóng)源及藥劑

供試米蛾購(gòu)自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，在（27±1）℃、75%～85%RH的實(shí)驗(yàn)室條件下用玉米粉飼養(yǎng)數(shù)代，以日齡計(jì)算，將3齡幼蟲(chóng)作為試蟲(chóng)。

碘化硫代乙酰膽堿、5，5－二硫基－雙－（2－硝基苯甲酸）（DTNB）、毒扁豆堿、1，2－二氯－4－硝基苯（CDNB）、還原型谷胱甘肽（GSH）、N，N’－甲叉雙丙烯酰胺（Bis）、丙 烯 酰 胺 （Acr）、三 羥 甲 基 氨 基 甲 烷（Tris）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA鈉鹽）、四甲基乙二胺（TEMED）、α－乙酸萘酯、β－乙酸萘酯，購(gòu)自重慶百萃生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。酸性磷酸酯酶（ACP）、堿性磷酸酯酶（AKP）試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3 酶活力測(cè)定

酶液的制備：將米蛾3齡幼蟲(chóng)饑餓1h，置于稻谷粉‘Ⅱ優(yōu) MS67’及對(duì)照上飼喂，在取食12、24、36、48、60h和72h后，將5頭幼蟲(chóng)放入預(yù)冷過(guò)的玻璃勻漿器中，加入1.5mL pH7.0的0.1mol／L磷酸緩沖液，冰浴勻漿。勻漿液在4℃、10 000g條件下離心10min。取上清液作為酶源。每處理重復(fù)5次。在Tecan酶標(biāo)儀下分析酶活力。

α－乙酸萘酯酶活力測(cè)定：參照 Van Asperen［13]方法并加以改進(jìn)。反應(yīng)混合液中含有10μL酶液（用前稀釋1倍）、90μL 0.04mol／L pH7.0的磷酸緩沖液、50μL 4×10－4mol／L的α－乙酸萘酯液，在37℃水浴中保溫30min，加入50μL顯色劑（1%固藍(lán)B鹽與SDS溶液按2∶5混合），室溫下放置10min，600nm波長(zhǎng)光比色，測(cè)其A值。每處理重復(fù)測(cè)定3次，以下均同。以α－萘酚作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

α－乙酸萘酯羧酸酯酶活力測(cè)定：參照Van Asperen［13]方法并加以改進(jìn)。反應(yīng)混合液中含有75μL酶液、100μL 3×10－4底物溶液（含0.03mol／Lα－乙酸萘酯液和1×10－4mol／L毒扁豆堿液），混勻，在37℃水浴中保溫30min，加入25μL顯色劑（1%固藍(lán)B鹽與SDS溶液按2∶5混合），室溫下放置10min，600nm處比色，測(cè)其A值。

乙酰膽堿酯酶活力測(cè)定：參照Ellman［14]方法并加以改進(jìn)。反應(yīng)混合液中含有50μL酶液，50μL 0.1mol／L pH7.0的磷酸緩沖液，100μL 1.5mmol／L碘化硫代乙酰膽堿，在37℃水浴中保溫10min，加入100μL 0.3mmol／L DTNB液，在37℃、412nm條件下比色，測(cè)其A值在20min內(nèi)的變化，1min讀1次數(shù)。

谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶活性測(cè)定：參照 Ranch ＆Nauen［15]的方法，反應(yīng)混合液含50μL 0.6mmol／L CDNB、50μL 6mmol／L GSH，反應(yīng)體系先于37℃水浴中保溫20min，再加入酶液50μL，在37℃，340nm條件下比色，測(cè)其A值在5min內(nèi)的變化，30s讀數(shù)1次。

酸性磷酸酯酶和堿性磷酸酯酶活性測(cè)定：具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。測(cè)定原理：酸性磷酸酯酶和堿性磷酸酯酶分解磷酸苯二鈉，產(chǎn)生游離酚和磷酸，酚在堿性溶液中與4－氨基安替吡啉作用經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成紅色醌衍生物，根據(jù)紅色深淺可以測(cè)定酶活力的高低。

1.4 酯酶同工酶電泳

酶液的制備：將米蛾3齡幼蟲(chóng)饑餓1h，置于‘Ⅱ優(yōu)MS67’稻谷粉及對(duì)照上飼喂，在取食72h后，將5頭幼蟲(chóng)放入預(yù)冷過(guò)的玻璃勻漿器中，加入勻漿緩沖液，冰浴勻漿。勻漿液在4℃，20 000g條件下離心30min，取上清液作為酶源。

電泳采用DYY－12型電腦三恒多用電泳儀。將制備好的分離膠和濃縮膠膠板放入4℃冰箱中預(yù)冷30min，用微量注射器量取酶液各25μL，分別注入加樣孔中，每種酶液異膠處理3個(gè)重復(fù)。采用恒流方式，在濃度為3.5%濃縮膠中，電流12mA，進(jìn)入濃度為7.5%的分離膠后增加至24mA。電泳時(shí)間約4h，整個(gè)電泳過(guò)程中將電泳槽置于4℃恒溫冰箱以保持酶的活性。

剝膠、染色、脫色及成像：電泳結(jié)束后在預(yù)冷的蒸餾水中剝膠，將膠移至固藍(lán)染色液中，置于黑暗、37℃水浴條件下染色45～60min。然后轉(zhuǎn)入脫色液中脫色，直至膠的背景為無(wú)色，約為2h。用SX－300型凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行酶譜分析［16]。

1.5 可溶性蛋白含量測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)G－250法測(cè)定［17]，以牛血清蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.6 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，差異顯著性比較采用獨(dú)立樣本成組數(shù)據(jù)的平均數(shù)比較t測(cè)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)sck／cry1Ac基因稻谷對(duì)米蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)α－乙酸萘酯酶和α－乙酸萘酯羧酸酯酶活力的影響

米蛾在取食轉(zhuǎn)sck／cry1Ac基因稻谷后，其體內(nèi)α－乙酸萘酯酶的活力變化較為明顯，隨著取食時(shí)間的延長(zhǎng)，α－乙酸萘酯酶的活力逐漸被抑制，24h后各處理均顯著低于對(duì)照（p＜0.05），在24h和48h時(shí)達(dá)到極顯著（p＜0.01），48h后，α－乙酸萘酯酶的活力均在對(duì)照的一半以下，到72h與對(duì)照的活力比值僅為0.37。α－乙酸萘酯羧酸酯酶的活力變化與α－乙酸萘酯酶呈相反趨勢(shì)，隨著取食時(shí)間的延長(zhǎng)，在24h后各處理均顯著高于對(duì)照（p＜0.05），在24、36、48h和72h時(shí)與對(duì)照差異都達(dá)到極顯著水平（p＜0.01），在60h時(shí)活力達(dá)到對(duì)照的1.93倍。

表1 取食轉(zhuǎn)sck／cry1Ac基因稻谷不同時(shí)間后米蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)α－乙酸萘酯酶及α－乙酸萘酯羧酸酯酶活力的變化1）

2.2 轉(zhuǎn)sck／cry1Ac基因稻谷對(duì)米蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)乙酰膽堿酯酶和谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶活力的影響

從表2可以看出，米蛾在取食sck／cry1Ac轉(zhuǎn)基因稻谷后，隨著取食時(shí)間的延長(zhǎng)，乙酰膽堿酯酶活力有升高的趨勢(shì)，24h后各處理均顯著高于對(duì)照（p＜0.05），36h和48h時(shí)差異達(dá)到極顯著（p＜0.01），在36h時(shí)活力達(dá)到對(duì)照的1.56倍。在米蛾取食期間，谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶的活性與對(duì)照相比變化不大，在24h時(shí)，顯著低于對(duì)照（p＜0.05），之后其活 性保持穩(wěn)定，與對(duì)照無(wú)顯著差異。

表2 取食轉(zhuǎn)sck／cry1Ac基因稻谷不同時(shí)間后米蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)乙酰膽堿酯酶及谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶活力的變化1）

2.3 轉(zhuǎn)sck／cry1Ac基因稻谷對(duì)米蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)酸、堿性磷酸酯酶活力的影響

表3顯示，米蛾在取食轉(zhuǎn)sck／cry1Ac基因稻谷后，酸性磷酸酯酶和堿性磷酸酯酶的活性都呈下降趨勢(shì)，酸性磷酸酯酶活力在12h和72h時(shí)顯著低于對(duì)照（p＜0.05），在72h時(shí)差異達(dá)極顯著水平（p＜0.01），72h時(shí)與對(duì)照的活力比值為0.75。堿性磷酸酯酶活力在24h后均顯著低于對(duì)照（p＜0.05），在48h和72h時(shí)差異達(dá)極顯著水平（p＜0.01），48h時(shí)與對(duì)照的活力比值最低，為0.40。

表3 取食轉(zhuǎn)sck／cry1Ac基因稻谷不同時(shí)間后米蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)磷酸酯酶活力的變化1）

2.4 酯酶同工酶電泳比較

取食轉(zhuǎn)Bt基因稻谷和對(duì)照稻谷72h后米蛾幼蟲(chóng)酯酶同工酶電泳圖譜見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，兩處理均有4條明顯的譜帶，這4條帶顯色深淺不一，其中染色最深的酶帶在兩處理中都為Est3酶帶，與對(duì)照相比，差異最大的為Est4酶帶，其染色效果較對(duì)照淺很多，其余3條帶（Est1、Est2、Est3）的染色效果也較對(duì)照淺。表明米蛾幼蟲(chóng)取食轉(zhuǎn)Bt基因稻谷后，酯酶Est1、Est2、Est3、Est4的活性均有所下降，其中Est4酯酶活性下降最明顯。另外，與對(duì)照相比，酶帶的遷移距離未發(fā)生改變，說(shuō)明米蛾幼蟲(chóng)經(jīng)轉(zhuǎn)Bt基因稻谷飼喂誘導(dǎo)后，體內(nèi)酯酶同工酶的分子量沒(méi)有顯著變化。圖2中的染色密度掃描結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了圖1的結(jié)果。

3 討論

昆蟲(chóng)降解植物體內(nèi)帶毒性異源化合物是適應(yīng)環(huán)境的一種重要途徑［18]。這種適應(yīng)性前期表現(xiàn)在昆蟲(chóng)體內(nèi)酶活性的變化。羧酸酯酶、磷酸酯酶、乙酰膽堿酯酶和谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶是昆蟲(chóng)體內(nèi)主要解毒酶和保護(hù)酶［19－20]，對(duì)以上這些酶活性的研究有助于探討昆蟲(chóng)代謝毒蛋白機(jī)理。徐艷聆等報(bào)道取食轉(zhuǎn)Bt基因玉米后的玉米螟幼蟲(chóng)體內(nèi)α－乙酸萘酯酶有降低趨勢(shì)，乙酰膽堿酯酶有升高趨勢(shì)［9]，酸性磷酸酯酶和堿性磷酸酯酶都顯著降低［21]，本研究結(jié)果與其結(jié)論一致。但本研究顯示谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶的活性除飼喂24h外，處理與對(duì)照相比無(wú)顯著差異。

羧酸酯酶能水解脂族羧酸酯、芳族酯、芳族胺以及硫酯等酯類(lèi)化合物［22]。蘭亦全等報(bào)道羧酸酯酶活性提高是甜菜夜蛾對(duì)氰戊菊酯和順式氯氰菊酯產(chǎn)生抗性的重要原因之一［23]。本研究結(jié)果中，米蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)α－乙酸萘酯酶活性顯著下降，SCK／Cry1Ac毒蛋白抑制α－乙酸萘酯酶活性，從而干擾了其正常的生理代謝。這可能是轉(zhuǎn)Bt基因稻谷殺蟲(chóng)的重要機(jī)制之一。然而米蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)α－乙酸萘酯羧酸酯酶活性顯著升高，從而發(fā)揮出羧酸酯酶的解毒功能。

乙酰膽堿酯酶是昆蟲(chóng)神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的酶系之一，同時(shí)又是有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑的作用靶標(biāo)［24]，直接調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)神經(jīng)系統(tǒng)的功能。取食Bt棉甜菜夜蛾4齡幼蟲(chóng)體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶活力比取食常規(guī)棉低［25]。但徐艷聆等報(bào)道取食轉(zhuǎn)Bt基因玉米后的玉米螟幼蟲(chóng)體內(nèi)乙酰膽堿酯酶有升高趨勢(shì)，在72h活力達(dá)到對(duì)照的2.5倍［9]。棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)在取食Bt毒蛋白后體內(nèi)羧酸酯酶和乙酰膽堿酯酶的活力有所升高［26]。本研究結(jié)果中，米蛾幼蟲(chóng)取食Bt毒蛋白后，體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的活性有顯著升高。其活性升高可能補(bǔ)償于被SCK／Cry1Ac毒蛋白抑制的乙酰膽堿酯酶功能，進(jìn)而維持正常神經(jīng)傳導(dǎo)。表明乙酰膽堿酯酶可能在SCK／Cry1Ac毒蛋白的代謝中起到相當(dāng)重要的作用。

谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶是生物體內(nèi)普遍存在，清除異源性有毒化合物最為有效的解毒酶［27]。徐艷聆等報(bào)道GSTs活性顯著下降［9]，但也有報(bào)道GSTs對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)化合物并不直接代謝，而是間接起作用［28]。本研究結(jié)果中，GSTs活性在整個(gè)取食過(guò)程中與對(duì)照相比變化不大，除24h外均未形成顯著差異。說(shuō)明本研究的谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶可能沒(méi)有直接參與SCK／Cry1Ac毒蛋白代謝。

磷酸酯酶包括酸性磷酸酯酶和堿性磷酸酯酶，酸性磷酸酯酶稱(chēng)為溶酶體的標(biāo)記酶，堿性磷酸酯酶是一個(gè)刷狀緣膜標(biāo)志酶［19]。磷酸酯酶對(duì)外源毒素的解毒代謝和抗性的形成也起著重要作用［21]。本研究結(jié)果表明，米蛾幼蟲(chóng)在取食轉(zhuǎn)SCK／Cry1Ac毒蛋白基因稻谷后，隨著取食時(shí)間的延長(zhǎng)，酸性磷酸酯酶和堿性磷酸酯酶的活性都受到不同程度的抑制作用，表明這兩種磷酸酯酶直接參與Bt毒蛋白的代謝作用。另外，據(jù)報(bào)道昆蟲(chóng)取食轉(zhuǎn)Bt基因玉米后，隨時(shí)間延長(zhǎng)，體內(nèi)微環(huán)境變化，酶活力降低，造成幼蟲(chóng)拒食后饑餓［23]，從而使昆蟲(chóng)體重下降，加速昆蟲(chóng)的死亡。在本研究中，也發(fā)現(xiàn)可能由昆蟲(chóng)抗性機(jī)制的行為機(jī)理引起的類(lèi)似現(xiàn)象［29]。因此，也進(jìn)一步證明磷酸酯酶活力的變化對(duì)昆蟲(chóng)的拒食作用和體重的下降方面有著重要影響。

同工酶是具有相同或相似催化功能而分子結(jié)構(gòu)不同的一類(lèi)酶，其特點(diǎn)是用同一染色方法顯示出相同酶帶在遺傳和生化上的差異［30]。從酯酶同工酶電泳結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了以上酶活性測(cè)定結(jié)果。結(jié)果表明經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)基因稻谷處理的米蛾幼蟲(chóng)，酯酶的活性在總體上受到抑制，可能是由于經(jīng)sck／cry1Ac基因誘導(dǎo)，酯酶蛋白表達(dá)量減少?gòu)亩斐擅富钚缘慕档?，這需要進(jìn)一步進(jìn)行分子生物學(xué)研究證明。另外，米蛾對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)稻谷的抗性遺傳學(xué)還需進(jìn)一步研究。

總之，米蛾幼蟲(chóng)取食轉(zhuǎn)SCK／Cry1Ac毒蛋白基因稻谷后的一定時(shí)間范圍內(nèi)，α－乙酸萘酯酶活性下降變化呈極顯著，而α－乙酸萘酯羧酸酯酶活性升高變化呈極顯著，乙酰膽堿酯酶活性也顯著升高。但酸性磷酸酯酶、堿性磷酸酯酶和酯酶同工酶活性顯著降低。由此表明這些解毒酶和酯酶同工酶直接參與Bt毒蛋白的代謝作用。

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