小鼠異位節段性胰腺移植模型

薛亮 陳輝 嚴盛 鄭樹森

胰腺移植是當前治療胰島素依賴型糖尿病的一種有效手段，能實現血糖長期穩定，延緩和改善晚期并發癥的發生［1-3］。缺血再灌注損傷是胰腺移植后最顯著的非免疫性并發癥，其發生率達35%［4］，是導致移植胰腺功能不全甚至急性失功的重要因素。2007年，Maglione等［5］報道了小鼠頸部袖套法胰腺移植模型技術，該模型可以用于胰腺缺血再灌注損傷方面的研究。在此模型的基礎上，我們試圖建立一種新的套管技術小鼠異位節段性胰腺移植模型，為胰腺缺血再灌注損傷方面的實驗研究提供條件。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用雄性BALB/c小鼠12對(體質量20～25 g，上海實驗動物研究所提供)。所有動物實驗操作均依據浙江大學動物保護指導方針，符合美國國立衛生研究院“實驗動物保護和使用指南”要求。

1.2 胰腺移植手術

實驗小鼠采用1%戊巴比妥鈉麻醉(1 mL/100 g體質量)，仰臥固定后放置于溫度維持在35.5～37.0℃的加熱墊上。熱缺血時間計時點由供體手術中血管鉗夾閉胸主動脈起至UW液經腹主動脈灌注胰腺止。冷缺血時間計時點由供體手術中UW液經腹主動脈灌注胰腺起至受體手術中除去微型血管夾、移植胰腺恢復血供止。供、受體手術過程均盡量避免對胰腺的觸碰。

1.2.1 供體手術

沿供體小鼠腹壁前正中線切開進腹，小鼠腹腔專用拉鉤撐開固定，充分暴露手術視野。以兩根消毒棉簽將空腸、回腸、升結腸及右側橫結腸推向小鼠腹部左側(圖1A)，可發現近似平行的腸系膜上動脈和腹腔干。鈍性分離腸系膜上動脈、腹腔干及腹主動脈，腸系膜上動脈下方留置一段6-0絲線。仔細解剖肝門部，結扎并切斷膽總管和肝動脈，鈍性分離門靜脈。在靠近胃上極處結扎并切斷食管和胃短動脈，雙次結扎并切斷胃左動脈。結扎腸系膜上動脈(圖1B)。鈍性分離小鼠膀胱上方下腔靜脈和腹主動脈，經下腔靜脈注射1%肝素鈉溶液0.3 mL。打開小鼠胸腔，以血管鉗夾閉胸主動脈，切斷上、下方下腔靜脈，5 mL注射器抽取1 mL UW液經腹主動脈灌注胰腺。灌注完畢后可見胰頭與胰體尾部間分界線(圖1C)，結扎并切斷胰頭及主胰管，剔除胃和十二指腸部分。在盡可能靠近肝門處切斷門靜脈，獲得較大的門靜脈開口。切斷腸系膜上靜脈，結扎并切斷膀胱上方腹主動脈，在腹腔干與腹主動脈交叉點上方0.5 cm處切斷腹主動脈，確保沒有小的分支血管。結扎連接胰體尾部和脾臟的血管，保留脾臟切取胰腺，保存于4℃ UW液中(圖1D)。

圖1 供體手術

1.2.2 受體手術

沿受體小鼠右側頸部縱向切開，鈍性分離皮膚下方組織，以4個小夾子撐開，充分暴露手術視野。切除右側下頜下腺以獲取更多空間，于上、下極結扎胸鎖乳突肌并橫斷。游離右側頸總動脈和右側頸外靜脈，結扎并切斷分支。使用微型血管夾阻斷近端右頸總動脈和右頸外靜脈，保留足夠長度用以安裝套管，結扎并切斷遠端右頸總動脈和右頸外靜脈，以少量肝素鈉溶液沖洗血管內壁并取出全部血栓。近端靜脈和動脈分別采用外徑為0.94 mm和0.63 mm的聚乙烯套管(英國Portex公司)。將斷端血管末端外翻完整包繞套管，以10-0絲線結扎固定(圖2)。

圖2 供體頸部血管套管

1.2.3 胰腺植入

供體小鼠節段性胰腺置于受體小鼠右側頸部，位置擺放正確以防止血管扭曲引起血栓。將受體小鼠右側頸總動脈套管塞入供體胰腺腹主動脈(圖3A)，受體小鼠右側頸外靜脈套管塞入供體胰腺門靜脈(圖3B)，均以7-0絲線結扎固定。依次除去靜、動脈微型血管夾，觀察移植胰腺血供狀況及吻合口是否出血，準備少許明膠海綿及小棉球防止吻合口出血(圖3C)。切除脾臟，觀察移植胰腺15～20 min。為避免移植胰腺暴露于空氣中，防止干燥，可在移植胰腺表面覆蓋濕潤的細紗布，并不斷用37℃乳酸林格液濕潤。受體小鼠股靜脈注射0.3 mL生理鹽水以補充術中液體丟失。術后立即予保溫燈加熱照射受體小鼠至移植后2 h，同時給予食物和水。

1.3 觀察指標

手術成功率、手術時間、熱缺血時間、冷缺血時間、微循環。

圖3 胰腺植入過程

2 結果

共完成小鼠頸部異位節段性胰腺移植手術12例。11例移植手術成功(術后2 h時受體小鼠存活)，成功率92%。動、靜脈套管內無血栓形成，血流良好，無吻合口出血。1例移植手術因胰腺植入過程中未完成套管連接導致大出血失敗。供體小鼠手術持續時間(40±5)min(35～45 min)，受體小鼠頸部分離時間(20±5)min(15～25 min)，套管連接時間5～10 min。供體小鼠胰腺熱缺血時間小于5 min，冷缺血時間(40±5)min(35～45 min)。

移植術后2 h，受體小鼠尾靜脈注射熒光染料(0.4%異硫氰酸熒光素，0.3 mL/只)，熒光顯微鏡下觀察10 min，可見移植胰腺微循環血供豐富(圖4)。

圖4 熒光顯微鏡下可見移植胰腺微循環血供豐富(×320)

3 討論

胰腺移植的動物模型經歷了從狗等大型動物到小型動物大鼠、進而到小鼠的過程。Lee等［6］首次報道了大鼠的胰腺移植模型。Tori等［7］改進并建立了小鼠胰十二指腸移植模型，但是存活率僅為46%。相對于大鼠器官移植模型，小鼠器官移植模型有其特有的優勢:近交系小鼠在我國易獲得;轉基因小鼠技術成熟;實驗成本低，可作大樣本研究［8］，尤其是價值昂貴的新型免疫抑制劑及生物制品的研究。但小鼠器官移植模型對操作者的顯微外科技術有較高的要求。

Maglione等［5］建立的小鼠頸部袖套法胰腺移植模型，其供體胰腺是完整胰腺組織。我們在該模型的基礎上進行了改進。(1)基于胰頭部胰腺組織動脈供血主要源自腸系膜上動脈，而胰體尾部胰腺組織動脈供血主要源自腹腔干，因此在供體手術中，將腹腔干和腸系膜上動脈雙動脈全胰腺移植改為單腹腔干節段性胰腺移植，摸索出新的小鼠胰腺移植模型。選取長度適中的腹腔干行血管重建，盡可能避免湍流形成，減少血栓形成概率，獲得穩定的血流動力學，保證移植胰腺的血供。(2)受體手術中，盡可能剔除頸部靜脈血管壁外脂肪組織，有利于受體靜脈套管安裝，同時減少脂肪組織堆積阻塞套管內部空間而引起的狹窄。小鼠頸總動脈直徑約為0.13～0.15 mm，動脈套管的安裝是本手術的難點。我們選用個體較大的小鼠作為受體，同時于頸總動脈分叉處切斷，獲得盡可能大的開口，提高受體動脈套管安裝成功率。胰腺植入過程中，供、受體之間的血管連接是整個手術成敗的關鍵所在，需要選擇合適的套管材質和直徑尺寸。因此，我們采用Portex公司的聚乙烯套管，靜脈套管外徑為0.94 mm，動脈套管外徑為0.63 mm。由于受顯微鏡視野和方向的限制，胰腺植入手術中血管連接套扎時只能看到正面的血管壁和套扎絲線，套扎前需要在下方安置7-0絲線，從下往上結扎。需要兩位手術人員勤加練習，提高配合默契程度。(3)在整個手術中，盡量避免觸碰供體胰腺，減少術中摩擦、觸碰胰腺組織而引起的胰腺炎。

相對于其他小鼠胰腺移植模型而言，我們采用該套管技術速度快，減少冷缺血時間，重建后血栓形成和出血的概率小;將腹腔干和腸系膜上動脈雙動脈全胰腺移植改為單腹腔干節段性胰腺移植，可以避開胰頭與十二指腸部分的分離，一定程度上降低了顯微操作難度。總之，借助套管技術，小鼠頸部異位節段性胰腺移植模型可以為胰腺缺血再灌注損傷方面的實驗研究提供條件。

1 Sutherland DE，Gruessner R， Kandswamy R， et al. Beta-cell replacement therapy(pancreas and islet transplantation)for treatment of diabetes mellitus:an integrated approach［J］.Transplant Proc，2004，36(6):1697-1699.

2 Giannarelli R，Coppelli A，Sartini M，et al.Effects of pancreaskidney transplantation on diabetic retinopathy ［J］.Transpl Int，2005，18(5):619-622.

3 Lipshutz GS， Wilkinson AH. Pancreas-kidney and pancreas transplantation for the treatment of diabetes mellitus［J］.Endocrinol Metab Clin North Am，2007，36(4):1015-1038;x.

4 Fernández-Cruz L，Sabater L，Gilabert R，et al.Native and graft pancreatitis following combined pancreas-renal transplantation［J］.Br J Surg，1993，80(11):1429-1432.

5 Maglione M，Hermann M，Hengster P，et al.A novel technique for heterotopic vascularized pancreas transplantation in mice to assessischemia reperfusion injury and graft pancreatitis［J］.Surgery，2007，141(5):682-689.

6 Lee S， Tung KS， KoopmansH， etal. Pancreaticoduodenal transplantation in the rat［J］.Transplantation，1972，13(4):421-425.

7 Tori M，Ito T，Matsuda H，et al.Model of mouse pancreaticoduodenal transplantation［J］.Microsurgery，1999，19(2):61-65.

8 Niimi M.The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice:experience of 3000 operations by one surgeon［J］.J Heart Lung Transplant，2001，20(10):1123-1128.