茚三酮法定性定量檢測絲氨酸

關洪亮，熊 倩，余訓民，李慶新

(武漢工程大學環境與城市建設學院，湖北 武漢 430074)

0 引 言

隨著人們對絲氨酸生理作用的深入認識和醫藥保健事業的不斷發展，醫藥、食品、飼料等行業對絲氨酸的需求量正迅速擴大.雖然L-絲氨酸屬于非必需氨基酸，但它卻具有許多重要的生理功能及用途，在醫藥、食品、化妝品中均有較為廣泛的應用.因此，測定混合氨基酸中絲氨酸的含量對絲氨酸的開發利用具有重要意義.

α-氨基酸與茚三酮在弱酸性溶液中共熱，反應后經失水脫羧生成氨基茚三酮，再與水合茚三酮反應生成紫紅色或藍色物質，如圖1.脯氨酸等仲胺氨基酸與茚三酮反應生成黃色物質.絲氨酸和茚三酮在弱酸性條件下共熱可以生成紫紅色的縮合物質[1-3]，且其顏色隨著絲氨酸的含量變化而有所不同.

圖1 α-氨基酸與茚三酮的顯色反應Fig.1 Colour reaction of α-amino acid and ninhydrin

上述反應生成的紫紅色縮合物顏色的深淺還與反應的pH、顯色劑的用量、反應的溫度及時間有關.本文利用顯色反應，采用比色法定量檢測絲氨酸并探討了最佳的反應條件.

1 實驗材料與方法

1.1 實驗儀器與試劑

722E可見光分光光度計；層析濾紙；毛細管；25 μL微量進樣器；薄層色譜展開缸(規格100×100)；干燥箱；帶塞玻璃試管(比色管).

1g/L的L-絲氨酸標準溶液：稱取0.1 g絲氨酸溶于100 mL去離子水中.

展層劑：按照“正丁醇∶95%乙醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶1∶2”比例配制，均為AR.

0.1%茚三酮溶液：稱取0.1 g茚三酮溶于95%乙醇中，定容至100 mL，均為AR.

層析液(0.1%茚三酮-展層劑)：每10 mL展層劑中加入2.5 mL 0.1%茚三酮溶液.

洗脫液：按照“V(0.1%CuSO4)∶V(75%乙醇)=2∶38”比例配制.稱取0.156 5 g CuSO4·5H2O溶于去離子水中，定容至100 mL，配制成0.1%CuSO4溶液.

待測樣品：氨基酸混合液，含有絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸等.

1.2 實驗方法

1.2.1 茚三酮法定性檢測絲氨酸 將預先配制的層析液倒入展開缸中靜置20 min，使缸內環境達到平衡，在距濾紙下端2 cm處劃一橫線，將待測樣品用毛細管點樣于橫線上，點樣半徑不要超過2 mm，將L-絲氨酸標準溶液用毛細管點樣于距待測樣品點1.5 cm處的橫線上，點樣半徑不要超過2 mm.待樣液自然揮發干后傾斜放入展開缸中，下端1 cm左右浸入層析液中，上端高出展開缸的部分延展開缸邊緣折疊掛于展開缸上，確保濾紙不與展開缸內壁接觸，如圖2.待層析液上行至距折線1 cm左右時取出濾紙，放入105 ℃的干燥箱中干燥5 min[4].

圖2 層析示意圖Fig.2 Diagrammatic sketch of chromatography

1.2.2 茚三酮法定量檢測絲氨酸 將預先配制的層析液倒入展開缸中靜置20 min，使缸內環境達到平衡，在距濾紙下端2 cm處劃一橫線，用微量進樣器取1 g/L絲氨酸標準溶液點樣于橫線

上，待樣液自然揮發干后傾斜放入展開缸中，如圖2.待層析液上行至距折線1 cm左右時取出濾紙，放入干燥箱中，在105 ℃條件下干燥5 min.干燥后的濾紙上會呈現明顯的氨基酸顯色斑點，剪下氨基酸顯色斑點，將其放置于帶塞玻璃試管中(比色管)，用4 mL洗脫液洗脫35 min，再倒入比色皿中靜置24 h(確保液體中的紙末全部沉淀)，以洗脫液為對照樣，在722E分光光度計上(波長570 nm處)測定吸光度[5-6].

2 檢測結果與討論

2.1 茚三酮顯色反應的影響因素

2.1.1 溶液pH的影響 用1 mol/L的NaOH溶液和1+1的硫酸溶液將層析液分別配制成pH為1.03、2.02、2.50、3.05、4.50的溶液，用微量進樣器取5 μL絲氨酸標準溶液點樣，進行層析顯色.

由于層析液在堿性條件下分層，所以用1 mol/L的NaOH溶液和1+1的硫酸溶液將1 g/L絲氨酸標準溶液分別配制成pH為6.56、8.77、9.50、11.05、12.05，取5 μL點樣，將層析液配制成弱堿性溶液，進行層析顯色[7].

實驗結果歸納于表1.

表1 pH對顯色反應的影響Table 1 pH on the colour reaction

注： 1 g/L絲氨酸標準溶液5 μL；105 ℃下烘干5 min；每10 mL展層劑加入2.5 mL 0.1%茚三酮溶液

由表1可知，當溶液pH低至2.0時不顯色，從pH為2.5開始有淡紫色出現，但pH超過9.5時淡紅色不是很明顯，之后不再顯色，可知顯色范圍在2.50～9.50之間，α-氨基酸[1]和茚三酮的顯色反應對介質的pH值非常敏感.

學者研究表明：α-氨基酸和茚三酮顯色反應中，主要的顏色產物均通過縮合形成.與羰基化合物和氨的衍生物之間的反應類似，在弱酸性條件下，這種縮合反應更容易發生[5,8]，酸性條件還能減少氨基以外的其它基團對顯色反應的干擾，使顯色反應生成的顏色產物更穩定.強酸性介質中雖然能增強茚三酮或1,3-茚三酮羥基的反應能力，但在強酸性條件下卻降低了參與縮合反應的氨基、羥基等新核基團的活性，使有色的縮合產物形成困難而且縮合生成的顏色產物在強酸性介質中也不穩定.在堿性條件下，顯色反應需加熱才能完成，而且在離熱后，空氣中的氧分子或其他氧化物容易與還原型的有色縮合產物發生氧化還原反應，引起顏色變化甚至褪色.又因在堿性介質中，很多基團或化合物的還原能力得到加強，擴大了茚三酮的顯色反應范圍，使得副反應增多，從而使反應、反應產物及產物顏色變得復雜化，在分子內部因素和外來因素的雙重影響和干擾下，不利于茚三酮對α-氨基酸的檢驗和測定，并且堿性介質中顏色的不穩定也妨礙了對α-氨基酸的準確分析[5].

綜上所述，α-氨基酸和茚三酮的顯色反應宜在弱酸性下進行.因此，本實驗中選定層析液的pH為4.50左右.

2.1.2 顯色劑用量的影響 取8組20 mL配制好的展層劑，分別加入0.4、1.2、2.0、2.8、3.6、4.4、5.2、6.0 mL 0.1%茚三酮溶液，作為層析液，調節層析液pH至4.50左右.用微量進樣器取1 g/L絲氨酸標準溶液15 μL點樣于濾紙上，進行層析[9-10].按照實驗方法測定每個顯色體系的吸光度并繪制成圖，結果見圖3.

圖3 顯色劑用量對吸光度的影響Fig.3 Dosage of chromogenic agent on absorbance

由圖3可看出，吸光度開始時隨著顯色劑用量的增加而增大，然后趨于平衡.當顯色劑用量為2.2 mL時，吸光度上升到最大，之后再增加顯色劑用量，吸光度基本無明顯變化，因此顯色劑用量為2.2 mL時最佳.因此，本實驗中選擇每10 mL展層劑中加入2.5 mL顯色劑.

2.1.3 反應溫度及時間的影響 反應需在加熱狀態下進行，因此反應溫度及時間對顯色效果也存在較大影響.取4組20 mL展層劑，分別加入5 mL顯色劑并調節pH至4.50左右.用微量進樣器取1 g/L絲氨酸標準溶液15 μL點樣于濾紙上，進行層析[7].分別放入105、90、75、60 ℃的溫度下顯色，結果見表2.

表2 反應溫度及時間對顯色效果的影響Table 2 Reaction temperature and time on colour effects

注： 絲氨酸標準溶液為1 g/L；每10 mL展層劑中有2.5 mL顯色劑.

由表2可知，當溫度為60 ℃時，即使加熱13 min以上也只顯出淡紫色；溫度為75 ℃時，加熱7.5 min才出現顏色變化；溫度為90 ℃時，加熱6.5 min就有顏色變化；當溫度上升到105 ℃時，加熱3.7 min即出現明顯的顏色變化.綜合各方面的考慮，反應的最佳條件應選在105 ℃下加熱4～5 min.若加熱時間過長會導致顯色斑點顏色擴散，影響吸光度的測定.

2.2 實驗結果分析

2.2.1 標準曲線的繪制 取5組20 mL層析液，pH調至4.55，用微量進樣器分別取1 g/L絲氨酸標準溶液5、10、15、20、25 μL點樣于層析濾紙上，按實驗方法進行實驗，測定吸光度，以標準溶液的用量與吸光度做絲氨酸標準曲線[10]，見圖4.

圖4 絲氨酸標準曲線Fig.4 Standard curve of serine

從圖4可知，絲氨酸用量與吸光度呈線性關系，其回歸線方程為y=0.001 7x-0.000 2，相關系數R2=0.993 8.

2.2.2 測定方法的精密度 精密度[11]一般用相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)表示.

取一定量的絲氨酸溶液，按照實驗方法，進行多次比色測定(n=5)，計算絲氨酸含量，結果見表3.

表3 重復性實驗結果Table 3 Repetitive experimental results

注： pH為4.55；105 ℃下烘干5 min；每10 mL展層劑加入2.5 mL 0.1%茚三酮溶液.

由此可見，此測定方法的重復性較好，精密度較高，比較可靠.

3 結 語

茚三酮比色法定量檢測絲氨酸操作簡單、成本低.只要控制好實驗條件，就能取得較好的測量結果.本文探討了溶液pH、顯色劑用量、反應溫度及時間對茚三酮比色法定量檢測絲氨酸的影響，測定了絲氨酸標準曲線并得到了最佳實驗條件：溶液pH為4.50，顯色劑用量為每10 mL展層劑中加入2.5 mL 0.1%茚三酮顯色劑，在105 ℃下加熱5 min.

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