化濁解毒活血通絡方對腦缺血再灌注損傷小鼠血清IL-6和TNF-α水平的影響

趙見文田軍彪張顏偉李佃貴楊麗靜

（1河北醫(yī)科大學，河北省石家莊市中山東路361號，050017；2河北省中醫(yī)院）

實驗研究

化濁解毒活血通絡方對腦缺血再灌注損傷小鼠血清IL-6和TNF-α水平的影響

趙見文1田軍彪2張顏偉1李佃貴2楊麗靜2

（1河北醫(yī)科大學，河北省石家莊市中山東路361號，050017；2河北省中醫(yī)院）

目的：觀察化濁解毒活血通絡方對小鼠腦缺血再灌注損傷的局部炎癥反應的影響。方法：將50只昆明小鼠隨機均分為模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組、尼莫地平組、假手術(shù)組。采用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法合并尾端放血制造腦缺血再灌注模型。手術(shù)造模成功分別給予高、低劑量組化濁解毒活血通絡方中藥灌服。在治療后用放免法檢測各組小鼠血清中IL-6、TNF -α的表達水平。結(jié)果：化濁解毒活血通絡方高劑量組小鼠中IL-6和TNF-α的表達水平明顯低于模型組，與假手術(shù)組及尼莫地平組比較無統(tǒng)計學意義。結(jié)論：化濁解毒活血通絡方可以抑制小鼠腦缺血再灌注損傷時炎癥細胞因子的表達，減少白細胞的浸潤，降低腦缺血再灌注損傷的程度。

化濁解毒活血通絡方；腦缺血再灌注；炎癥反應；白介素-6；腫瘤壞死因子-α

腦缺血再灌注損傷（Cerebral Ischemia Reperfusion Injury）是一個以缺血缺氧為始動因素，腦組織細胞在再灌注作用下所產(chǎn)生的包括炎癥反應、氧自由基生產(chǎn)增多、鈣超載、興奮性氨基酸毒性、凋亡基因激活等諸多環(huán)節(jié)共同存在從而導致神經(jīng)元凋亡的級聯(lián)反應。腦缺血誘導的炎癥細胞因子如白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factorα，TNF-α）等的表達在腦缺血再灌注炎癥損傷中起著重要作用。化濁解毒活血通絡法是以濁毒理論［1-2］為指導，根據(jù)濁毒致病理論與腦系疾患的相關(guān)性研究而確立的中醫(yī)治療體系，廣泛應用于缺血性腦血管病治療之中。本研究采用線拴法造成小鼠腦缺血再灌注模型，觀察化濁解毒活血通絡方對模型小鼠炎癥細胞因子IL-6和TNF-α表達的影響及其對神經(jīng)元產(chǎn)生保護作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器及藥物 試驗動物：健康昆明雄性小鼠50只（河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，體重20～23g，SPF級）。試驗儀器：離心機、循環(huán)水真空泵、γ-放射免疫計數(shù)器、電子天平等。化濁解毒活血通絡方組成：菖蒲、茯苓、澤瀉、黃連、川芎、丹參、赤芍、當歸、地龍、郁金等。對照組藥物：尼莫地平；試劑：TNF-α和IL-6放免檢測試劑盒（解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所提供）。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗動物分組及模型的構(gòu)建 健康昆明小鼠50只隨機分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組、中藥高劑量組、中藥低劑量組5組，每組10只。在25℃的無菌環(huán)境內(nèi)行手術(shù)造模。用10%水合氯醛以350mg/kg腹腔注射麻醉后，取仰臥位將小鼠四肢與牙齒分別固定于操作臺上，背部置一松軟棉墊，腹部覆蓋適量棉絮。在小鼠前頸部剪毛備皮，碘伏酒精常規(guī)消毒。頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈，套4號絲線扣備用，拉緊絲扣，阻斷血流。手術(shù)過程中動作輕柔規(guī)范，嚴格執(zhí)行無菌操作。術(shù)后可見小鼠驚厥、呼吸深慢、心跳加快、口唇發(fā)紫，同時在距尾尖1cm處剪斷放血。在放血過程中需謹慎觀察小鼠生命體征，放血約0.3mL迅速熱凝止血。阻斷血流10min松開絲扣，灌注10min后，再次阻斷血流10min，第二次再灌注后觀察10min，如小鼠呼吸、心跳平穩(wěn)，即可縫合皮膚，傷口處輕灑少量青霉素粉末以預防感染。其中假手術(shù)組僅分離頸總動脈，套絲扣不阻斷血流，尾部不放血，觀察時間與其他各組相同。隨后參考Longa等評分法［3］對小鼠的行為缺陷進行評價，1～4分者納入后期試驗，無神經(jīng)功能缺失癥狀及死亡者立即剔除并及時補充。

1.2.2 試驗動物的給藥方法 腦缺血再灌注損傷模型小鼠于術(shù)后第二天開始給藥。假手術(shù)組、模型組給予生理鹽水10mL/（kg·d）灌服。中藥高劑量組以上述中藥2.9g/（kg·d）灌服，中藥低劑量組以上述中藥1.45g/（kg·d）灌服。尼莫地平組灌服尼莫地平液0.03g/（kg·d），均每日1次，連續(xù)治療7d。

1.2.3 放免法檢測血清IL-6和TNF-α水平 各組小鼠于治療結(jié)束后以摘除小鼠眼球的方式取得血清，離心后取上清液，采用放免法檢測血清中IL-6和TNF-α水平。

1.3 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，SPSS11.0軟件包進行統(tǒng)計學處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 各組小鼠血清中IL-6和TNF-α的含量

2 結(jié)果

各組小鼠血清中IL-6和TNF-α的含量見表1。結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組與化濁解毒方低劑量組小鼠血清中IL-6、TNF-α含量顯著升高（P＜0.01），化濁解毒方高劑量組、尼莫地平組無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，化濁解毒方低劑量組小鼠血清中IL-6與TNF-α水平均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），化濁解毒方高劑量組小鼠血清中IL-6、TNF -α含量顯著降低（P＜0.01）。與尼莫地平組比較，化濁解毒方低劑量組小鼠血清中IL-6、TNF-α顯著升高（P＜0.01），化濁解毒方高劑量組無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與化濁解毒方低劑量組比較，化濁解毒方高劑量組小鼠血清中IL-6、TNF-α含量顯著降低（P＜0.01）。

3 討論

IL-6是一種重要的前炎癥細胞因子，它是一種由多個氨基酸組成的糖蛋白，具有較高的生物活性。在生理條件下，IL-6在腦內(nèi)的表達僅處于低水平狀態(tài)。腦缺血再灌注損傷后，隨著中性粒細胞以及巨噬細胞的浸潤IL-6表達明顯增加。TNF-α在腦組織中主要是由小膠質(zhì)細胞和星形細胞分泌產(chǎn)生。它具有復雜廣泛的生物學效應，能介導IL-6等多種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和免疫調(diào)節(jié)，并參與影響脂質(zhì)以及糖類等物質(zhì)的代謝過程。腦組織缺血缺氧以及血液再灌注時，TNF -α能夠刺激損傷血管內(nèi)皮細胞使得白細胞對血管內(nèi)皮的黏附性增強，內(nèi)皮細胞的凝血活性狀態(tài)被改變，PAF、TXA2、ET等縮血管物質(zhì)被釋放，進而發(fā)生血管收縮并最終導致血管的急性閉塞。TNF-α還能使興奮性氨基酸釋放增加，產(chǎn)生神經(jīng)毒性。炎癥反應在中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血損傷中起著關(guān)鍵作用［4］。當腦缺血再灌注損傷時，包括IL-6和TNF-α等在內(nèi)的多種炎性細胞因子表達增多，在細胞表面浸潤。IL-6和TNF-α等炎性細胞因子的釋放增加繼發(fā)諸多級聯(lián)反應導致血腦屏障被打破，局部腦組織發(fā)生腫脹變性及神經(jīng)元的損傷。

本研究顯示，化濁解毒活血通絡方高劑量組IL-6和TNF-α的表達水平明顯低于局灶性腦缺血再灌注模型組，與假手術(shù)組及尼莫地平組比較無顯著性差異。化濁解毒活血通絡方對腦缺血再灌注損傷小鼠有明顯的保護作用，其作用機制可能與抑制腦缺血再灌注后炎性細胞因子TNF-α、IL-6的產(chǎn)生、拮抗TNF-α、IL-6引發(fā)的一系列損傷，以減輕其神經(jīng)毒性。但化濁解毒活血通絡方對于腦缺血再灌注損傷級聯(lián)反應中的氧自由基生成、鈣超載、興奮性氨基酸毒性、凋亡基因激活等其他環(huán)節(jié)有無調(diào)節(jié)作用目前還不明確，尚待研究的進一步深入。

［1］李佃貴，李海濱，裴林，等.慢性萎縮性胃炎從濁毒論治.四川中醫(yī)，2004，22（1）：17.

［2］吳深濤，糖尿病病機的啟變要素—濁毒.上海中醫(yī)藥大學學報，2004，18（1）：24.

［3］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson s，et al.Reversible midge Cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.stroke，1989，20（1）：84.

［4］Elkind MS，Coates K，Tai W.etal.Levels of acute phase proteins.remain stable after isehemie stroke.BMC Neur0l，2006，（16）6：37.

（2010-12-10收稿）

Impact of Huazhuo Jiedu Huoxue Tongluo Formula on IL-6 and TNF-α in Rats with Ischemia-reperfusion Injury

Zhao Jianwen1，Tian Junbiao2，Zhang Yanwei1，et al.
（1 Hebei Medical University，Add.：No.361，Zhongshan East Road，Shijiazhuang，Hebei Province，postal code：050017；2 Heibei Hospital of Chinese Medicine）

Objective：To investigate impact of Huazhuo Jiedu Huoxue Tongluo Formula on local inflammatory reaction in rats with ischemia-reperfusion injury.Methods：Forty Kunming mice were randomized to model group，high dose group，low dose group，Nimodipine group and sham operation group.Through ligature on bilateral carotid artery the disease model was established.The medication groups respectively

high dose or low dose of the Chinese medicine.After treatment，IL-6 and TNF-α levels were determined.Results：The high dose group showed significantly lower level of IL-6 and TNF-α than the model group did，but the difference was not significant in comparison to sham operation group and Nimodipine group.Conclusion：Huazhuo Jiedu Huoxue Tongluo Formula can inhibit expression of inflammatory reaction factors，reduce inflammatory reaction so as to lower the intensity of ischemia-reperfusion injury.

Huazhuo Jiedu Huoxue Tongluo Formula，ischemia-reperfusion injury，Inflammatory reaction，IL-6，TNF-α

國家中醫(yī)藥管理局濁毒證重點研究室專項課題（編號ZD200821-10）；河北省中醫(yī)藥管理局科研計劃課題（編號2010020）