伊貝沙坦對胰島素抵抗大鼠腎間質(zhì)中TGF-β1表達的影響

劉冰 王利軍 牛凱 史亞男

在腎臟病患者中，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)可調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)，促進細胞外基質(zhì)(ECM)的合成和沉積，減少ECM的降解，腎間質(zhì)纖維化主要是由于細胞外基質(zhì)產(chǎn)生與降解失衡以及成纖維細胞過度增生所致［1］。伊貝沙坦對胰島素抵抗腎組織中TGF-β1表達的影響與腎間質(zhì)纖維的關(guān)系和機制尚不清楚。為此進行了相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物的來源與分組 8周齡雄性SD大鼠32只，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。將大鼠隨機分為對照組，模型組，伊貝沙坦50mg/kg、100mg/kg干預(yù)組，每組8只。模型組以高脂高糖飼料喂養(yǎng)，對照組一直予以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)直至實驗結(jié)束。干預(yù)組中伊貝沙坦(法國Sanofi公司提供)溶于蒸餾水按大鼠體重灌胃，飼料喂養(yǎng)與模型組相同。喂養(yǎng)12周后處死動物，觀察結(jié)果。

1.2 收縮壓(SBP)的測定 在每周日早晨8∶00～10∶00將大鼠在箱中預(yù)熱38℃，10min后，用尾袖法測量大鼠尾動脈血壓。

1.3 空腹血糖(FBG)、胰島素(FINS)測定 喂養(yǎng)12周后，大鼠禁食12 h過夜，血糖儀檢測空腹血糖(FBG);酶聯(lián)免疫法測定血清胰島素(FINS);計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)，公式為(Ins×FBG)/22.5，統(tǒng)計時取自然對數(shù)使其符合正態(tài)性，再進行統(tǒng)計。

1.4 組織病理學(xué)檢查 SD大鼠處死后立即取腎臟組織液氮冷凍，－70℃保存。用Trizol RNA提取試劑盒提取總RNA，RTPCR按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行。TGF-β1 PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性 5min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s，32個循環(huán)，最后72℃保溫10min。GAPDHPCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性 5min，94℃變性 30 s，51℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，30個循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)112%瓊脂糖電泳和凝膠成像系統(tǒng)分析，計算與內(nèi)參照β-actin吸光度A比值。取10 μl的RT-PCR產(chǎn)物，加入2 μl的DNA上樣緩沖液，混勻后加樣。以1×TPE作為電泳液，V/cm恒壓恒流電泳，電泳1 h，停止電泳，多功能凝膠分析儀下觀察結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，在進行方差齊性檢驗后，組間比較用單因素方差分(ANOVA)，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠的血壓變化 模型組收縮壓較對照組、伊貝沙坦50mg/kg干預(yù)組高，伊貝沙坦100mg/kg組血壓明顯低于于其他3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)。見圖1。

圖1 喂養(yǎng)12周4組大鼠血壓變化

2.2 FBG、FINS、ISI和 TGF-β1mRNA 表達的變化 實驗結(jié)束時4組動物FBG之間，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。4組模型組胰島素水平顯著高于其他3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。4組 HOMA-IR模型組明顯高于其他組(P ＜0.01)。伊貝沙坦可抑制大鼠腎組織TGF-β1基因表達，與模型組比較有明顯統(tǒng)計學(xué)差異，伊貝沙坦100組大鼠腎組織TGF-β1基因表達與伊貝沙坦50組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 4 組 FBG、FINS、HOMA-IR 和 TGF-β1/β-actin的比較 n=8，

表1 4 組 FBG、FINS、HOMA-IR 和 TGF-β1/β-actin的比較 n=8，

注:與模型組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01;與伊貝沙坦50 組比較，△P ＜0.05

-actin對照組 6.02 ±0.38 39.22 ±9.25* 0.78 ±0.16#組別 FBG(mmol/L) FINS(mU/ml) HOMA-IR TGF-β1/β 0.62 ±0.03模型組 6.05 ±0.26 51.45 ±10.25 1.89 ±0.29 1.75 ±0.06*伊貝沙坦 50 組 6.35 ±0.86 35.24 ±9.24* 1.22 ±0.21# 1.35 ±0.05#伊貝沙坦 100 組 6.26 ±0.76 31.23 ±9.96* 1.05 ±0.22# 1.03 ±0.04#△

3 討論

具有致纖維化作用因子及血管活性物質(zhì)，TGF-β是其中最主要的，TGF-β1是調(diào)節(jié)細胞增殖和分化的一種多功能細胞因子，特別在調(diào)控細胞外基質(zhì)(ECM)聚積中起中心調(diào)節(jié)作用。TGF-β1主要通過自分泌及旁分泌發(fā)揮生物學(xué)作用，它通過控制細胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)化來抑制細胞增生，誘導(dǎo)細胞肥大;同時它能增加腎小球上皮細胞、系膜細胞、腎近曲小管上皮細胞和成纖維細胞ECM蛋白分子的合成，抑制基質(zhì)降解蛋白酶如膠原酶的合成，阻止ECM的降解，結(jié)果使ECM成分升高，減少ECM的降解，腎間質(zhì)纖維化主要是由于細胞外基質(zhì)產(chǎn)生與降解失衡以及成纖維細胞過度增生所致。

近十年許多大型臨床試驗表明了阻斷RAS系統(tǒng)可以延緩腎功能衰竭的發(fā)展。伊貝沙坦是一個對AT1受體有特異性拮抗作用，通過選擇性地阻斷AngⅡ與AT1受體的結(jié)合，抑制血管收縮和醛固酮的釋放，產(chǎn)生降壓作用。伊貝沙坦不抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、腎素、其它激素受體，也不抑制與血壓調(diào)節(jié)和鈉平衡有關(guān)的離子通道，但對胰島素抵抗的影響尚不十分清楚。本研究表明高脂高糖喂養(yǎng)使大鼠的胰島素抵抗指數(shù)升高，伊貝沙坦組大鼠胰島素抵抗指數(shù)較高脂高糖喂養(yǎng)組明顯降低(P＜0.01)，與正常大鼠組接近。說明模型組大鼠發(fā)生胰島素抵抗，而伊貝沙坦可改善胰島素抵抗。

本研究顯示持續(xù)或間斷的高脂高糖環(huán)境，可促使腎小球系膜細胞肥大，TGF-β1mRNA和蛋白的表達量增高，TGF-β1是目前公認的最重要的致纖維化生長因子，誘導(dǎo)多種細胞外基質(zhì)成分mRNA表達增加［3］。TGF-β1基因具有多態(tài)性，而且這種多態(tài)性能影響其轉(zhuǎn)錄，并與多種因素引起的TGF-β1水平特征性升高密切相關(guān)。可是伊貝沙坦劑量不同對TGF-β1 mRNA的表達不能達到正常水平，伊貝沙坦大劑量對大鼠腎組織TGF-β1mRNA表達的影響明顯優(yōu)于小劑量伊貝沙坦。伊貝沙坦還能減弱因高脂高糖喂養(yǎng)而造成TGF-β的表達，減少ECM沉積［4，5］。在腎病治療中，需要高于常規(guī)ARB劑量的數(shù)倍用藥才能充分抑制TGF-β1表達，獲得更多的腎臟保護效果。為臨床腎病用藥開辟新思路。

1 Kimura Y，Okuda H，Okuda T，et al.Studies on the activities of tannins and related compounds，X.Effects of caffeetannins and related compounds onarachidonate metabolism in human polymorphonuclear leukocytes.J Nat Prod，2007，50:392-399.

2 李光偉.當前胰島素敏感性評估及胰島素抵抗研究中的某些誤區(qū).中華內(nèi)科雜志，1998，37:81-83.

3 房輝，徐剛，于德民，等.TGF-β1和ECM與糖尿病腎病關(guān)系的實驗研究.中國糖尿病雜志，2000:227-230.

4 Schnaper HW，Hayashida T，Hubchak SC，et al.TGF-beta signal transduction and mesangial cell fibrogenesis.Am J Physiol Renal Physiol.2003，284:F243-252.

5 Klahr S，Morrissey J.Obstructive nephropathy and renal fibrosis.Am J Physiol Renal Physiol，2002，283:F861-75.