替勃龍對大鼠神經細胞Bcl-2、Bax表達的影響

宋月平 蘇立凱 鐘婭莉 田文艷

研究發現，雌激素替代治療能使絕經期女性卒中的相對危險度(RR)及與卒中相關的病死率下降［1］。然而雌激素替代治療對腦卒中的影響機制迄今仍不十分清楚。本文觀察了替勃龍在去勢大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷中腦缺血神經細胞凋亡及其相關蛋白表達的影響，旨在探討它們對缺血性腦損傷的神經保護作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

1.1.1 實驗動物 5月齡健康雌性SD大鼠30只，體重250～270 g，由河北醫科大學實驗動物中心提供(動物使用許可證號:SCXK2003-1-003)。試驗期間所有動物置于同一室內，二級環境分籠飼養，自由飲水，室溫(21±4)℃，光照12 h，黑暗12 h。

1.1.2 實驗分組:將上述SD大鼠按體重隨機分為3組:假手術組、對照組、替勃龍組，每組10只。假手術組行下腹切開，見到雙側卵巢，但不切除任何組織;其余2組于腦缺血術前14 d切除雙側卵巢。替勃龍組，替勃龍(荷蘭歐加農生產，南京歐加農制藥分裝)0.25mg·kg－1·d－1，灌胃;對照組每日同等量蒸餾水灌胃。凡術中出現大鼠死亡，蛛網膜下腔出血或未存活到規定的時間點者，均為模型制作失敗，不納入本實驗，再隨機從備用組補充相應的大鼠，以保證每組實驗大鼠數量不變。

1.2 腦缺血再灌注模型制作 用改良Longa法制作大腦中動脈阻斷(MCAO)模型［1］。以10%水合氯醛(0.33 g/kg)腹腔注射麻醉后，暴露并鈍性游離左側頸總動脈(CCA)，結扎同側CCA近心端和頸外動脈(ECA)分叉部，距CCA末端約5 mm處剪口，用直徑0.24 mm的日本尼龍線沿頸內動脈(ICA)方向插入，深度由分叉部算約計(18.5±0.5)mm，于ICA近心端結扎該動脈，全層縫合切口，再灌注時抽出尼龍線10 mm。以動物清醒后爬行時向右轉圈(追尾現象)，嚴重時向右跌倒，提尾時右前肢內收屈曲，為入選標準。于腦缺血手術2 h后再灌注，24 h后斷頭取腦。

1.3 觀察指標

1.3.1 神經功能評分:參考Bederson等［2］的5分制評分標準，于取腦前評分。0分:無神經損傷癥狀;1分:不能完全伸展右側前爪;2分:向右側轉圈;3分:向右側傾倒;4分:不能自發行走，喪失意識。包括術后24 h內死亡。

1.3.2 腦梗死體積測定:大鼠腦缺血2 h，再灌注24 h后斷頭取腦。取左側大腦半球，冠狀面均勻切成2 mm厚腦片，染色固定，照相測量并計算出總的梗死體積。用計算機多媒體彩色圖像分析系統測量腦梗死體積。

1.3.3 免疫組化細胞凋亡的檢測:大鼠腦缺血2 h，再灌注24 h后斷頭取腦，距額極3～5 mm冠狀切取材，放入4%多聚甲醛固定24 h后，制成石蠟切片，用于免疫組織化學染色。①采用TUNEL法原位標記DNA片段檢測凋亡細胞。具體步驟參照產品說明書，原位細胞凋亡檢測試劑盒為美國ROCHE公司出品。②采用鏈酶菌抗生物素蛋白過氧化物酶法(streptavidin peroxidase，SP)檢測抗凋亡基因Bcl-2、細胞凋亡誘導因子Bax的表達。Bcl-2、bax多克隆抗體購于河北博海生物工程有限公司。③采用多功能真彩色細胞圖像分析管理系統(美國Media Cybernetics公司Image-Pro Plus)。在光鏡下分析圖象，每張切片采集缺血周邊區具有代表性10個高倍視野，計算平均數。

1.4 統計學分析應用SPSS 10.0統計軟件，計量資料以表示，多組間比較進行方差分析，兩兩比較采用q檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 神經功能評分 假手術組神經功能評分為(1.1±0.4)分，替勃龍組(2.3 ±0.5)分，假手術組為(1.3 ± 0.5)分，假手術組和替勃龍組與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。

2.2 梗死體積 替勃龍組與對照組比較梗死體積縮小，差異有統計學意義(P ＜0.05)。見表1。

表1 3組腦缺血模型大鼠梗死體積比較 n=10，

表1 3組腦缺血模型大鼠梗死體積比較 n=10，

注:與假手術組比較，*P ＜0.05;與對照組比較，#P ＜0.05

組別 半球體積(mm3) 梗死體積(mm3) 梗死體積百分比(%)260 ±8 47 ±5 18.2 ±2.2對照組 260±7 65±4* 25.3±2.4*替勃龍組 260±8 47±4# 18.2±2.2假手術組#

2.3 TUNEL標記結果 缺血組對側僅見數個陽性細胞散在分布，缺血側可見大量黃棕色陽性細胞，以圓形為主。假手術組陽性細胞數10%，替勃龍組陽性細胞數11%，對照組陽性細胞數28%，與對照組比較替勃龍組陽性細胞數明顯減少，差異有統計學意義(P ＜0.01)。見圖1。

2.4 Bcl-2、Bax在同側皮層表達的百分率 在腦組織切片中，Bcl-2、Bax陽性表達表現為胞質棕黃色深染。替勃龍組較對照組Bcl-2陽性細胞增多，Bax陽性細胞減少，差異有統計學意義(P ＜0.01)。見表2。

圖1 3組缺血側皮層陽性細胞(TUNEL×400)

表2 3組腦缺血模型大鼠腦皮層Bcl-2、Bax表達水平比較 n=10，

表2 3組腦缺血模型大鼠腦皮層Bcl-2、Bax表達水平比較 n=10，

注:與假手術組比較，*P ＜0.01;與對照組比較，#P ＜0.01

Bcl-2/Bax假手術組組別 Bcl-2表達(%) Bax表達(%)32.0 ±2.1 12 ±1 2.65 ±0.05對照組 5.2 ±1.0* 60 ±2* 0.09 ±0.01*替勃龍組 33.1 ±2.2# 11 ±1# 3.00 ±0.10#

3 討論

有研究證實外源性雌激素可以明顯降低實驗性MCAO大鼠的病死率，減少腦梗死面積，證明外源性雌激素具有缺血性神經保護作用［3］。據報道在大腦中動脈栓塞所致的局灶性腦缺血后，增加腦內的Bcl-2的表達，可減少神經細胞的凋亡，提示Bcl-2在缺血性腦損傷的病理發生中可能起內源性保護作用。Bcl-2家族是目前研究較為深入的與凋亡密切相關的基因，它既能阻抑壞死又能阻抑凋亡［4］。研究證明，線粒體外膜通透性的改變可引起細胞凋亡，而這種通透性的改變直接由Bcl-2家族蛋白控制［5］。Bcl-2家族包含一組相關蛋白，根據其成員在細胞凋亡中的作用分為兩類:一類為抗凋亡蛋白，包括Bcl-2;另一類為促凋亡蛋白，包括Bax［6］。抗凋亡蛋白成員和促凋亡蛋白成員之間的協同作用共同決定細胞是否進入凋亡程序。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中最重要的一對互相拮抗的凋亡相關因子，Bcl-2/Bax的比值在中樞神經細胞凋亡中起關鍵作用，比值高，細胞存活率高;比值低，細胞存活率低。測定Bcl-2/Bax比值有利于判斷是否發生凋亡。以往研究顯示一過性局灶性腦缺血后促凋亡蛋白Bax表達明顯增加，且Bax陽性反應位于 TUNEL陽性的細胞內，其時程與空間的分布與TUNEL陽性神經元一致［6］，提示Bax在介導缺血性神經元損傷中起重要作用，這與本實驗研究結果相符合。本實驗觀察到替勃龍用藥組Bcl-2蛋白表達陽性細胞數不同程度增加，而Bax的蛋白陽性細胞數不同程度下降，Bcl-2/Bax比值增加，說明替勃龍可能通過上調Bcl-2/Bax比值而對腦缺血再灌注所造成的損傷起到一定的保護作用。

本實驗結果顯示替勃龍通過增強缺血再灌注后腦組織內Bcl-2的表達，抑制Bax的表達，上調Bcl-2/Bax的比值，從而改善模型鼠缺血再灌注24 h后神經功能缺損評分，減輕腦梗死體積和腦水腫，表明替勃龍對局灶腦缺血再灌注損傷具有保護作用。

1 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversile middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rate.Stroke，1989，20:84-91.

2 Bederson JB，Pitts LH，TsujiM，et al.Rat middle cerebral artery occlusion evaluation of the model and development of a neurologic examination.Stroke，1986，17:472-476.

3 Zhang YQ，Shi J，Rajakumar G，et al.Effects of gender and estradiol treatment on focal brain ischemia.Brain Res，1998，784:321-324.

4 Wei MC，Zong WX，Cheng EHY，et al.Proapoptotic BAX and BAK:a reguisite gateway to mitochondrial dysfunction and death.Science，2001，292:727-730.

5 Orrenius S.Mitochondrial regulation of apooptotic cell death.Toxicol Lett，2004，149:19-23.

6 Hsu SY，Hsueh AJ.Tissue-specific Bcl-2 protein partners in apoptosis:An ovarian paradigm.Physiol Rev，2000，80:593-614.