葉酸對超早期斷奶宮內發育遲緩仔豬肝臟結構和細胞凋亡相關基因表達的影響

姚 英 陳代文 劉靜波 毛湘冰 毛 倩 余 冰

(四川農業大學動物營養研究所，動物抗病營養四川省重點實驗室，雅安 625014)

作為多胎家畜，豬發生先天性宮內發育遲緩(intrauterine growth retardation，IUGR)的概率最大，養殖場的經濟效益嚴重受損，因此是否能通過營養手段緩解該癥狀和促進IUGR個體正常生長對于養殖業的發展具有重要意義。肝臟作為機體最大的代謝器官之一，在養分代謝、生物合成和免疫防御等方面具有重要作用。IUGR發生時，細胞增殖較快的器官首先顯著受損，從而保證腦等器官的發育及機體的存活［1］。肝臟等器官的養分供應減少、質量減輕、結構和功能受損［1－3］。研究發現IUGR會導致機體凋亡相關基因表達改變［4］，并可通過改變基因甲基化程度影響基因的表達和機體的生理代謝［5］。促凋亡相關基因腫瘤蛋白53(p53)是細胞凋亡的關鍵調控因子，當它被激活可影響細胞周期停滯和誘導凋亡相關基因的表達，而其中B細胞淋巴瘤蛋白2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)和Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)是研究較多的 p53下游效應分子［6］。毛細血管擴張性共濟失調癥突變蛋白(ataxia telangiectasia mutated，ATM)和脫嘌呤嘧啶核酸內切酶1(apurinic/apyrimidinic endonuclease-1，APE-1)也可通過調節細胞周期關卡從而參與DNA損傷修復和細胞凋亡過程［7－8］。

葉酸作為重要的B族維生素，參與調控與蛋白質和DNA的合成、生物甲基化和基因表達等相關的一碳單位轉運［9］，在體內的代謝受到DNA甲基轉移酶 1(DNA methyltransferase 1，DNMT-1)、亞甲基四氫葉酸還原酶(methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR)和甜菜堿高半胱氨酸甲基轉移酶(betaine homocysteine methyltransferase，BHMT)等的影響。葉酸缺乏可導致細胞脫氧核苷酸庫不平衡、凋亡相關基因Bcl-2、Bax和p53等的表達出現異常，最終引起細胞DNA損傷、增殖減少、凋亡率增加和生長抑制;而補充葉酸可逆轉這些負面效應［10］。大鼠上的研究發現補充葉酸可增加肝細胞的再生能力，維持肝臟的正常形態和功能［11］。此外，葉酸可影響基因甲基化程度，從而改變基因的表達量［12］。生命早期機體的可塑性較強［13］，且出生后早期營養對于機體全期生長較為關鍵［1］，因此在這一階段實施營養干預可能改變機體已有的發育程序化。超早期斷奶后補充葉酸是否能在一定程度上緩解出生前環境對IUGR個體肝臟結構和功能的影響尚有待進一步的研究。因此，本試驗以自然發生IUGR的公仔豬為模型，考察超早期斷奶后補充不同水平的葉酸對仔豬肝臟結構和凋亡相關基因表達的影響，為IUGR仔豬的養殖提供理論依據，同時也為嬰兒營養臨床應用提供思路。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選取體況相近、產期接近的初產長白×約克夏母豬(配種采用同一頭大白公豬精液)所產初生體重為0.9～1.1 kg的33頭仔豬，體重低于該養殖廠仔豬平均出生體重的2倍標準差定義為IUGR。14日齡斷奶時，選取其中24頭平均體重為(2.79±0.34)kg的仔豬隨機分為3個處理，分別飼喂基礎飼糧中添加0、5和10 mg/kg葉酸的試驗飼糧，每個處理8個重復，每個重復1頭豬。試驗期21 d。

1.2 試驗飼糧

妊娠期和哺乳期母豬飼喂相同飼糧。斷奶仔豬基礎飼糧組成及營養水平見表1，飼糧營養水平參考美國NRC(1998)豬營養需要配制。在基礎飼糧中分別添加0、5和10 mg/kg葉酸配制成試驗飼糧。葉酸純度≥98%，購于帝斯曼維生素(上海)有限公司。

1.3 飼養管理

仔豬14日齡斷奶，單籠飼養，自由采食和飲水，飼喂量以采食后料槽略有余料為準。試驗期第1～14天室內溫度控制在25～28℃，第15～21天室內溫度為23～26℃。試驗第1天和結束后第1天08：00(空腹12 h以上)對試驗豬進行稱重。

1.4 樣品收集與處理

1.4.1 血清樣品制備

試驗結束后第1天仔豬空腹稱重后，前腔靜脈采血10 mL，靜置30 min后3 000 r/min離心10 min，分離血清，－20℃冰箱保存待測。

1.4.2 組織樣品的采集

采血后仔豬進行麻醉，取出肝臟稱濕重后取部分組織樣品，用生理鹽水沖洗干凈后，迅速放入4%中性福爾馬林固定液中固定，保存待制組織切片。另速取部分肝臟組織樣品于液氮中速凍，并及時將樣品放入－80℃中保存待測。

1.5 測定指標與方法

1.5.1 血清葡萄糖和甘油三酯

血清葡萄糖濃度采用葡萄糖氧化酶－4－氨基安替比林(GOD-PAP)法測定，血清甘油三酯濃度采用甘油磷酸氧化酶－過氧化物酶－4－氨基安替比林和酚(GPO-PAP)法測定，均使用全自動生化分析儀(日立7020，日本)進行，試劑盒購于四川邁克生物科技股份有限公司，具體操作按試劑盒說明書進行。

1.5.2 肝細胞和肝小葉直徑

取置于4%中性福爾馬林固定液中的肝臟組織，經脫水、浸蠟、包埋、切片等處理，再經蘇木精－伊紅染色(hematoxylin and eosin staining，HE染色)，在顯微成像系統(尼康D70s，日本)下進行觀察(目鏡10倍、物鏡40倍)，每個樣本選擇8～10個切片，每個切片選4～5個視野，測量肝細胞和肝小葉直徑。

1.5.3 肝臟凋亡相關和葉酸代謝相關基因的表達量

實時定量PCR(real-time PCR)法測定肝臟Bcl-2、Bax、p53、ATM、APE-1、DNMT-1、BHMT、MTHFR的基因相對表達量。

肝臟組織總RNA提取按照試劑盒(Trizol Reagent，TaKaRa，日本)操作說明進行，提取的總RNA溶解于無RNA酶水(RNase Free dH2O，TaKaRa，日本)中。瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性。核酸蛋白檢測儀(Beckman Du－800，CA，美國)于260 nm檢測RNA濃度。

cDNA合成采用逆轉錄試劑盒(PrimeScriptTMreagent kit，TaKaRa，日 本)。反 應 體 系 10 μL：2 μL 5 × PrimeScriptTMBuffer，0.5 μL Prime-ScriptTMRT Enzyme Mix，0.5 μL Oligo dT Primer，0.5 μL Random 6 mers，4.5 μL RNase Free dH2O，2 μL總RNA。反應參數：37℃ 15 min;85℃ 5 s。反應結束后－20℃保存備用。

用實時定量PCR儀(CFX－96 Real-Time PCR System，Bio-Rad，美國)進行測定，反應熒光染料為SYBR?GreenⅠ(TaKaRa，日本)。反應體系 為 10 μL：5 μL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2 × )，1 μL上游引物，1 μL 下游引物，2 μL 雙蒸水，1 μL cDNA模板。利用NCBI搜索目的基因片段，運用 Primer 5、Oligo 6.0進行引物設計，由大連寶生物公司合成，引物序列見表2。反應程序：95℃預變性10 s;95℃變性5 s，目的基因特異性退火溫度(表2)條件下退火25 s，40個循環。用于檢測基因擴增產物特異性的熔解曲線反應程序為：95℃ 10 s;65℃ 25 s;95℃ 0 s(溫度變化速率為0.1℃/s)。表達量計算采用ΔΔCt和標準曲線擴增效率校正法，參照 Pfaffl等［14］，標準曲線采用10倍梯度稀釋法制作，每個樣品3個重復，試驗內參基因選用β－肌動蛋白。

1.6 數據處理和統計分析

所有數據采用SPSS 13.0進行單因素方差分析和Duncan氏法多重比較。結果以平均值±標準差表示，以P＜0.05為差異顯著標準，以 P＜0.01為差異極顯著標準。

2 結果

2.1 葉酸對仔豬血清葡萄糖和甘油三酯濃度的影響

由表3可知，添加葉酸對35日齡仔豬血清葡萄糖濃度無顯著性影響(P＞0.05)，飼糧添加5和10 mg/kg葉酸血清葡萄糖濃度分別下降了5.38%和5.91%。血清甘油三酯受葉酸水平的影響較大，與0 mg/kg組相比，5和10 mg/kg組分別顯著(P ＜0.05)和極顯著(P ＜0.01)地降低。

表2 實時定量PCR引物序列及參數Table 2 Sequences and parameters of primers for the real-time PCR

表3 葉酸添加水平對35日齡仔豬血清葡萄糖和甘油三酯濃度的影響Table 3 Effects of folic acid supplemental level on concentrations of glucose and TG in serum of piglets at 35 days of age mmol/L

2.2 葉酸對仔豬肝臟結構的影響

由圖1和表4可知，0 mg/kg組肝細胞直徑最大;與0 mg/kg組相比，5 mg/kg組肝細胞直徑顯著減小(P＜0.05);10 mg/kg組肝細胞直徑與其余2組相比無顯著性差異(P＞0.05)。添加葉酸對肝小葉直徑無顯著性影響(P＞0.05)，但飼糧添加5和10 mg/kg葉酸使仔豬肝小葉直徑分別下降了 5.78%和 7.57%。

2.3 葉酸對肝臟凋亡相關和葉酸代謝相關基因表達的影響

由表5可知，與0 mg/kg組相比，5 mg/kg組Bcl-2的基因表達量顯著升高(P＜0.05)，Bax和p53的基因表達量極顯著降低(P＜0.01);10 mg/kg組Bcl-2的基因表達量與其他2組無顯著差異(P＞0.05)，而Bax和p53的基因表達量分別極顯著(P ＜0.01)和顯著(P ＜0.05)地降低了，但與5 mg/kg組無顯著差異(P＞0.05)。

表4 葉酸添加水平對35日齡仔豬肝臟結構的影響Table 4 Effects of folic acid supplemental level on liver structure of piglets at 35 days of age μm

添加葉酸對ATM和APE-1的基因表達無顯著影響(P ＞0.05);與0 mg/kg組相比，5 mg/kg組ATM和APE-1的基因表達量分別降低了11%和21%。葉酸和蛋氨酸循環的關鍵酶編碼基因DNMT-1、BHMT和MTHFR的表達量未受飼糧葉酸水平的顯著影響(P＞0.05)。

表5 葉酸添加水平對35日齡仔豬肝臟凋亡相關和葉酸代謝相關基因相對表達的影響Table 5 Effects of folic acid supplemental level on the relative expression level of apoptosis-related and folic acid metabolism-related genes in the liver of piglets at 35 days of age

3 討論

IUGR可導致新生兒高死亡率和畸形率，并影響機體組成和長期健康，造成重大經濟損失，目前對于IUGR的研究主要集中在IUGR的危害及預防措施上［15］，通過營養干預和飼養管理改善IUGR個體的存活和健康方面仍少有報道。IUGR對器官結構和功能、機體生理代謝的深遠影響提示IUGR個體通過表觀遺傳學調控著相關基因的表達［16］。機體在出生后早期細胞大量增殖、生長迅速［17］，同時擁有較強的發育可塑性［13］，葉酸作為一碳單位載體，其在體內的代謝與核酸合成、蛋白質代謝和生物甲基化等過程密切相關［9］。因此本試驗以IUGR仔豬為模型，研究在出生后早期飼糧中添加葉酸對肝臟結構和功能的影響。

Burdge等［5］在大鼠上的研究表明，對蛋白質不足母大鼠后代，28日齡斷奶后飼糧添加5 mg/kg葉酸對血清葡萄糖和甘油三酯濃度無顯著影響，而妊娠期母大鼠飼糧補充5 mg/kg葉酸則可顯著降低后代血清葡萄糖和甘油三酯濃度［18］。本試驗結果表明，IUGR仔豬超早期斷奶后飼糧添加5和10 mg/kg葉酸對血清葡萄糖水平無顯著影響，但分別顯著和極顯著降低了血清甘油三酯濃度。結果出現差異的原因可能與實施營養干預時機體所處狀態、模型動物自身生理狀態和葉酸處理時間長短的差異有關。

本試驗發現，飼糧添加5和10 mg/kg葉酸有降低肝小葉直徑的趨勢，且5 mg/kg組顯著降低了肝細胞直徑，而10 mg/kg組肝細胞直徑無顯著變化，提示添加5 mg/kg葉酸能夠促進肝細胞數量的增加，而10 mg/kg葉酸有減少肝細胞數量的趨勢。提示出生后早期飼糧添加5 mg/kg葉酸有利于肝細胞的增殖，而10 mg/kg葉酸對肝細胞增殖無正面效應。Roncales等［11］也發現補充葉酸可以改善大鼠肝細胞的再生能力，增加肝細胞核密度和肝細胞數目，維持肝臟的正常形態。IUGR仔豬生長緩慢，超早期斷奶后肝臟細胞數量可能仍在變化。那么肝細胞數量的差異是否與細胞凋亡有關呢?

Bcl-2和Bax是Bcl家族中研究最為廣泛的抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，通過信號途徑激活細胞半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶－3(caspase-3)，促進細胞凋亡過程中的染色質凝聚和DNA斷裂。Bcl-2參與細胞凋亡抑制過程，緩解Bax的促凋亡效應，對正常細胞起保護作用［19］。p53是凋亡過程的關鍵調控因子，是凋亡級聯途徑的有效元件，也是一個轉錄因子。正常情況下，p53低水平表達，且蛋白質周期較短。應激、缺氧和DNA受損時，細胞核中p53出現蓄積，并作為轉錄因子被激活，負調控 Bcl-2的表達，與 Bax的表達呈正相關［6，20］。正常生理條件下，一方面，APE-1 可抑制氧化應激，保護細胞免遭凋亡;另一方面，APE-1可通過氧化還原與非氧化還原的方式活化p53，從而促進p53靶基因Bax等的轉錄活化［8］。DNA損失可激活ATM，后者通過磷酸化反應激活DNA修復相關蛋白、損失應激蛋白及p53等，以促進細胞凋亡、細胞修復或細胞周期抑制［7］。葉酸參與了DNA前體物質嘌呤、嘧啶的形成，與DNA復制、修復和穩定性相關。有研究表明，葉酸缺乏會導致機體或細胞DNA損傷、細胞增殖減少、凋亡增加［21］。本實驗室的前期研究也發現，母體補充葉酸可以緩解IUGR仔豬Bcl-2、Bax和p53的基因表達發生變化［4，22］。本試驗結果發現，5 mg/kg葉酸顯著增加了Bcl-2的基因表達，降低了Bax和p53的基因表達，而ATM和APE-1的基因表達呈下降的趨勢;添加10 mg/kg葉酸并未進一步改善肝臟結構和細胞凋亡相關基因的表達。近年研究發現，長期過量補充葉酸可能損傷機體神經功能、免疫功能和蛋白質代謝，并與一些癌癥的發生有關，機體的葉酸代謝相關生化指標與葉酸缺乏時類似［23－25］。迄今為止，關于葉酸過量產生負面效應的具體機制仍不明確，有待進一步研究。

DNMT-1是DNA甲基化的關鍵酶，其表達直接影響DNA甲基化狀態。在葉酸介導的一碳單位代謝中，BHMT利用甜菜堿催化同型半胱氨酸轉化為蛋氨酸，與蛋氨酸合酶(methionine synthasse，MS)的作用一致;MTHFR調控5－甲基四氫葉酸的形成，而后者是葉酸的活化形式，被MS利用從而促進同型半胱氨酸的再甲基化。本試驗中，肝臟 DNMT-1、BHMT和MTHFR的基因表達量未受葉酸水平的顯著影響，而細胞凋亡相關基因出現差異性表達，這可能與甲基化的基因特異性有關。Engeham等［26］的研究也表明母體補充葉酸時，DNMT-1、MTHFR和MS的基因表達未受影響。葉酸介導的一碳單位代謝是一個復雜的相互作用的系統，系統內大范圍的調節機制使機體整體的葉酸和蛋氨酸循環處于穩態。過多葉酸會與葉酸結合蛋白結合，這些葉酸結合蛋白是葉酸循環過程中的催化酶，具有變構效應，葉酸的結合使變構酶的反應速率下降;過量葉酸可導致5－甲基四氫葉酸蓄積。有研究指出過量5－甲基四氫葉酸(5-MTHF)會向胞外轉移，導致胞內葉酸庫容量下降，即葉酸過量的效應與葉酸缺乏癥狀相似。當5-MTHF利用減少時，肝臟動用BHMT途徑以緩解該效應［26－28］。

4 結論

①飼糧補充一定水平的葉酸有助于改善超早期斷奶IUGR仔豬35日齡時肝臟結構和細胞凋亡相關基因Bcl-2、Bax和p53的表達。

②本試驗條件下，飼糧添加5 mg/kg葉酸效果較好。

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