扁桃體和外周血CD8+T細胞表達CXCR5和IL-21水平對比分析

方會珍，曹莉萍

(1、江西省中醫藥研究院檢驗科，江西 南昌 330046；2、南昌大學第二附屬醫院檢驗科，江西 南昌 330006)

扁桃體是人體的次級淋巴組織。近年來，在次級淋巴組織的生發中心(Germinal center,GC)發現了一個特殊的CXCR5+CD4+T細胞亞群，被命名為濾泡輔助性T細胞(follicular T helper cells,Tfh)，目前認為是B細胞產生抗體和發生類別轉換，執行有效的體液免疫應答的主要輔助性T細胞亞群[1-2]。然而，在GC反應中，T細胞與B細胞的相互作用機制及過程迄今為止并未完全清晰，尤其是CD8+T細胞在其中是否發揮作用，目前文獻也鮮見報道。本文利用流式細胞檢測技術，分析比較了扁桃體和正常人外周血中CD8+T細胞表達CXCR5和IL-21的水平，為進一步探討外周淋巴組織中CD8+T細胞的異質性提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗對象 15例扁桃體組織來自因反復炎癥發作而行扁桃體切除(不分側別)的患者，其中男性10例，女性5例，年齡5～28歲，平均17.3歲。每位患者術前兩周內均無急性發炎史，且未行任何抗菌素治療，術前血尿常規檢查均正常。12例外周血標本來自健康體檢者，男性8例，女性7例，年齡10～42歲，平均22.8歲。

1.2 主要試劑和儀器 RPMI-1640 不完全培養液、牛血清白蛋白(BSA)、佛波酯(PMA)、離子霉素(Ionomycin)購自美國Sigma 公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，淋巴細胞分離液購自中國醫學科學院血液學研究所，FITC 標記的鼠抗人CD8 單克隆抗體(FITC-CD8 mAb)、APC-CXCR5 mAb、PE-CD69 mAb 及其同型對照購自美國BD Pharmingen 公司，PE-IL-21mAb 及其同型對照購自美國eBioscience公司，流式細胞儀Calibur 購自美國BD 公司。

1.3 人扁桃體單個核細胞的制備 將手術摘除的新鮮扁桃體組織,用生理鹽水或Hank′s 液反復洗滌,剪去外周的結締組織,將扁桃體剪成小塊,用組織勻漿器將其碾磨制成細胞懸液,并用篩網過濾懸液，以淋巴細胞分離液分離出扁桃體中的單個核細胞，臺盼藍拒染法測定細胞數量和活力，備用。

1.4 人外周血單個核細胞(PBMCs)的制備 抽取健康體檢者外周血，淋巴細胞分離液密度梯度離心法分離人PBMCs,臺盼藍拒染法測定細胞數量和活力，備用。

1.5 流式抗體染色細胞表面分子的染色：將細胞懸液調成1×106/ml的濃度，用PBS 洗滌細胞1～2次，100μl細胞懸液中加入一定量的抗體，4℃避光孵育30min，PBS 再洗滌細胞1～2次，倒去上清，上流式細胞儀進行檢測。IL-21的染色：1×106/ml的細胞懸液中加入激活劑PMA和Ionomycin，同時加入阻止細胞因子分泌至胞外的阻斷劑布雷菲德菌素A(BFA)，37℃孵育4min 后，收集細胞，PBS 洗滌細胞，4%的多聚甲醛固定細胞10min，然后加入含1%皂甙的破膜劑于室溫避光處放置10min，PBS洗滌細胞，棄上清，最后加入熒光標記的IL-21 抗體，4℃避光孵育30min 后，洗滌細胞，上機檢測分析。

2 結果

2.1 扁桃體和PBMCs 中CD8+T細胞比例的差異流式細胞儀檢測結果發現，扁桃體組織中CD8+T細胞占淋巴細胞的比例僅為6.61%±1.91%，明顯低于正常人外周血中CD8+T細胞的比例(21.83%±4.56%)，兩者相比具有統計學意義(P<0.05)。結果見圖1。

圖1 扁桃體中CD8+T細胞比例低于PBMCs

2.2 扁桃體和PBMCs 中CD8+T細胞表達CD69的差異 檢測CD8+T細胞表面活化分子CD69 發現，與PBMCs 相比，扁桃體中CD8+T細胞表達CD69的水平明顯升高，CD8+CD69+T細胞占總CD8+T細胞的比例為42.83%±5.59%，而PBMCs 中CD8+T細胞表達CD69的水平極低，CD8+CD69+T細胞比例為2.93%±1.61%(見圖2)。兩組之間比較有統計學差異(P<0.05)。

圖2 扁桃體中CD8+T細胞高表達CD69

圖3 扁桃體和PBMC 中CD8+T細胞表達CXCR5的差異

2.3 扁桃體和PBMCs 中CD8+T細胞表達CXCR5的差異 FCM 檢測結果進一步顯示，扁桃體中CD8+CXCR5+T細胞占總CD8+T細胞的比例為15.05%±5.13%，正常人外周血中CD8+CXCR5+T細胞占總CD8+T細胞的比例為3.34%±1.63%(見圖3)，兩者相差非常顯著(P<0.05)。

2.4 扁桃體和PBMCs 中CD8+T細胞表達IL-21的差異為了解CD8+T細胞是否能夠產生IL-21，我們用多克隆刺激劑PMA和Ionomycin 刺激扁桃體單個核細胞和PBMCs，4h 后用FCM 檢測CD8+T細胞表面IL-21的表達情況。如圖4顯示，扁桃體中CD8+T細胞能檢測到IL-21的表達(占總CD8+T細胞的4.64%±1.71%)，但是PBMCs 中CD8+T細胞基本不表達IL-21 (占總CD8+T細胞的0.34%±0.27%)，兩者差異具有統計學意義(P<0.05)。

圖4 扁桃體中CD8+T細胞能產生IL-21

3 討論

扁桃體作為人體免疫器官中的一個特化的二級淋巴器官，由于其解剖部位顯要，且生理功能尤其是免疫功能還不甚明了，因此多年來一直是人們研究的熱點[3-4]。已經證實，扁桃體是一個富含B細胞的淋巴組織，目前普遍認為扁桃體的功能以體液免疫為主，對其細胞免疫了解甚少。但是，最近在次級淋巴組織的淋巴濾泡確定了一個新的CD4+T細胞亞群，稱之為Tfh。研究發現，Tfh細胞的一個重要表面標志是表達趨化因子受體CXCR5，該受體通過與其相應的配體CXCL13 作用，使Tfh細胞定位于次級淋巴組織的淋巴濾泡。此外，Tfh細胞的另一個重要特征是具有分泌IL-21的功能，在刺激B細胞的增殖、分化以及免疫球蛋白的類別轉換中起著十分重要的作用[5]。那么，在扁桃體等次級免疫器官中，CD8+T細胞是否也表達CXCR5和IL-21 呢？

眾所周知，除CD4+T細胞外，CD8+T細胞也是免疫系統中參與適應性免疫應答的一個重要功能性T細胞亞群，與CD4+T細胞不同的是，CD8+T細胞識別的是MHCⅠ類分子結合的病毒或細菌抗原肽，主要在抗胞內微生物感染中發揮細胞毒性作用[6]。在次級淋巴組織，CD8+T細胞定位于T細胞區，被抗原遞呈細胞(如DC)提呈的抗原適當刺激后，會迅速增殖并成為效應細胞。當被感染細胞逐漸被清除后，一部分抗原特異的CD8+T細胞被保留下來，成為長壽命記憶細胞，在二次免疫應答中發揮主要作用。CD8+T細胞介導的細胞毒效應主要通過靶向釋放溶細胞分子顆粒酶和穿孔素，以及表達死亡受體(Fas)等機制導致靶細胞損傷[7]。

本研究通過比較扁桃體和正常人外周血中的CD8+T細胞，證實扁桃體中CD8+T細胞的比例相對較少，且50%左右的CD8+T細胞組成性表達CD69，表明這些細胞可能處于早期分化和活化狀態[8]，這也可能與扁桃體中的免疫細胞經常接觸外來抗原、不同程度地發生了活化有關。更有趣的是，扁桃體中也存在一部分CD8+CXCR5+T細胞。有觀點認為，CD8+T細胞細胞表面不表達CXCR5[5]。盡管我們檢測到的這群CD8+CXCR5+細胞與CD8+CXCR5-細胞相比，表型和功能是否存在差異目前還不得而知，但扁桃體中CD8+CXCR5+T細胞的存在提示CXCR5 對于CD8+T細胞遷移到外周淋巴器官的作用同樣不可忽視。與扁桃體相比，我們在外周血中也檢測了較低比例的CD8+CXCR5+細胞。我們推測這群細胞可能是從外周淋巴器官循環至外周血中，我們的結果與Quigley MF[9]等的結果基本一致。最后，我們也檢測了CD8+T細胞產生IL-21的能力，發現只有扁桃體中的CD8+T細胞能產生IL-21，而外周血中CD8+T細胞不產生IL-21。雖然扁桃體中CD8+T細胞產生IL-21的水平遠遠低于CD4+T細胞，由于在外周淋巴組織，B細胞是IL-21 作用的主要靶細胞[10]，因此，CD8+T細胞產生的IL-21 是否能夠為B細胞提供輔助，還有待進一步深入研究。

總之，我們采用FCM 檢測方法，初步探討了扁桃體中存在一群CD8+CXCR5+和CD8+IL-21+T細胞，為進一步開展這兩群細胞的功能研究提供了良好的實驗基礎。

[1]McHeyzer-Williams LJ.Follicular helper T cells as cognate regulators of B cell immunity [J].Curr Opin Immunol,2009,21(3):266–273.

[2]Nutt SL，Tarlinton DM.Germinal center B and follicular helper T cells:siblings,cousins or just good friends [J].Nat Immunol,2011,12 (6):472-477.

[3]閔密克,馬超武,金伯泉,等.扁桃體B 淋巴細胞免疫功能的研究[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2009,23 (7):311-315.

[4]張 濤,丁 勇,王繼群,等.扁桃體組織中白細胞介素-4的表達和意義[J].中國病理生理雜志,2000,16 (2):150- 152.

[5]金伯泉.T-B細胞協作研究的重大突破—濾泡輔助性T細胞的發現,一個新的CD4+效應T細胞亞群[J].細胞與分子免疫學雜志,2009,5(1):1-5.

[6]Yewdell JW，Haeryfar SM.Understanding presentation of viral antigens to CD8+T cells in vivo:The key to rational vaccine design[J].Annu Rev Immunol,2005,23:651–682.

[7]Sallusto F,Geginat J，Lanzavecchia A.Central memory and effectormemory T cell subsets:Function,generation,and maintenance [J].Annu Rev Immunol,2004,22:745–763.

[8]Papagno L,Spina CA,Marchant A,et al.Immune activation and CD8+T-cell differentiation towards senescence in HIV-1 infection[J].PLoS Biol,2004,2:E20.

[9]Quigley MF,Gonzalez VD,Granath A,et al.CXCR5+CCR7-CD8 T cells are early effector memory cells that infiltrate tonsil B cell follicles [J].Eur J Immunol,2007,37 (12):3352-3362.

[10]Zaki K,Spolski R,Ettinger R,et al.Regulation of B cell differentiation and plasma cell generation by IL-21,a novel inducer of Blimp-1 and Bcl-6 [J].J Immunol,2004,173 (9):5361 -5371.