上下法與傳統(tǒng)急性毒性法測定薄荷油LD50的試驗(yàn)研究

張方舟，王 益，顏文君，周海鵬，周闖華，呂 坪

·法醫(yī)學(xué)·

上下法與傳統(tǒng)急性毒性法測定薄荷油LD50的試驗(yàn)研究

張方舟，王 益，顏文君，周海鵬，周闖華，呂 坪

目的本實(shí)驗(yàn)以薄荷油為目標(biāo)物，評價(jià)了上下法與傳統(tǒng)法小鼠急性毒性試驗(yàn)相比的優(yōu)缺點(diǎn)。方法采用薄荷油對小鼠灌胃，分別進(jìn)行上下法急性毒性試驗(yàn)與傳統(tǒng)法急性毒性試驗(yàn)，觀察中毒現(xiàn)象，計(jì)算LD50及其95%可信區(qū)間。結(jié)果上下法薄荷油急性毒性LD50為2 000 mg／kg（798.5～2 150 mg／kg），傳統(tǒng)法LD50為1 589.68 mg／kg（1 405.37～1 798.08 mg／kg）。結(jié)論兩種方法所得LD50值接近，毒性分級相同。上下法作為急性毒性替代法對于藥物安全性評價(jià)領(lǐng)域有較好的應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展前景。

上下法；傳統(tǒng)急性毒性法；半數(shù)致死量（LD50）；薄荷油

急性毒性實(shí)驗(yàn)應(yīng)用范圍很廣，例如食品、藥品、化妝品、農(nóng)藥、工業(yè)毒物等毒理學(xué)安全性評價(jià)。諸多研究表明，受多種內(nèi)部和外部因素影響，LD50（半數(shù)致死劑量）往往僅是一個(gè)統(tǒng)計(jì)數(shù)值。因此，隨著全球?qū)?dòng)物福利的關(guān)注，各種節(jié)省動(dòng)物使用量的急性毒性替代試驗(yàn)受到越來越多的關(guān)注。上下法（up-anddown procedure，UDP）是經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）于2001年發(fā)布的急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)方法之一，該方法不僅大大減少了動(dòng)物的使用量，并且可以最大似然法計(jì)算LD50值和95%可信區(qū)間［1－2］。該方法于2008年被我國接納為化學(xué)品檢驗(yàn)國家標(biāo)準(zhǔn)［3］，已有研究表明，UDP法測定農(nóng)藥等化學(xué)品急性經(jīng)口染毒的LD50與Horn’s法比較結(jié)果相近，毒性分級相似［1，4－6］。但對于藥物有效成分的毒性研究，目前傳統(tǒng)急性毒性試驗(yàn)及LD50值的精確測定仍是我國藥品注冊法規(guī)的組成部分，UDP法在此方面的適用性研究鮮見報(bào)道。尤其當(dāng)前，我國對傳統(tǒng)中藥材或天然藥物成分的安全性評價(jià)，缺失較為嚴(yán)重，相關(guān)藥物的急性毒性亟待研究。以薄荷油為例，具有多種藥理功能［7－8］，口服可用于消化道疾病，民間也常用于吸入劑治療惡心、嘔吐、緊張性頭疼等［9］。一般認(rèn)為其無毒，但有報(bào)道表明，大量口服可導(dǎo)致肝臟毒性［10］，或引發(fā)間質(zhì)性腎炎和急性腎衰相關(guān)的病癥［9］，并可能導(dǎo)致死亡［10］。

因此，本次試驗(yàn)研究擬以薄荷油作為受試物，通過比較UDP法與經(jīng)典法（改良寇氏法）LD50的測定結(jié)果，進(jìn)一步了解UDP法替代傳統(tǒng)方法對天然有效成分毒性研究的可靠性，為藥物安全性評價(jià)領(lǐng)域中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試物薄荷油（北京弘發(fā)中藥材飲片有限公司，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：Q／DCL004－2008），用芝麻香油配制成適當(dāng)乳液備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物KM小鼠，體質(zhì)量18～20 g，雌雄各半，由河南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)于河南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物房。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分組，雌雄各半，整個(gè)試驗(yàn)過程中，動(dòng)物自由攝水，每次給藥前一晚禁食不禁水。給藥前稱量體質(zhì)量，觀察14 d，記錄所需動(dòng)物數(shù)量和實(shí)驗(yàn)耗時(shí)。

1.3.1 傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)法 預(yù)實(shí)驗(yàn)：按一次給最大劑量法，給藥0.4 m L／10 g體質(zhì)量；取小白鼠20只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，分別灌胃給予5 mg／kg、50 mg／kg、500 mg／kg和2 000 mg／kg 4個(gè)固定劑量，另一組灌胃給水作為陰性對照組。正式實(shí)驗(yàn)：取50只小白鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，給予適當(dāng)濃度受試樣品灌胃。

1.3.2 UDP法 限度試驗(yàn)：限度劑量2 000 mg／kg（特殊情況限度劑量選擇5 000 mg／kg），用5只動(dòng)物進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，按照劑量水平的限度實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，估計(jì)LD50。正式實(shí)驗(yàn)：固定默認(rèn)Sigma（級數(shù)因子）0.5，相應(yīng)劑量組距3.2，劑量從以下序列中選擇：175 mg／kg、550 mg／kg、2 000mg／kg。第1只動(dòng)物給藥劑量低于LD50估計(jì)值，如果該動(dòng)物存活，第2只動(dòng)物給予高一劑量；如果第1只動(dòng)物死亡或?yàn)l死狀態(tài)，第2只動(dòng)物給予低一劑量。在此程序中每次給藥1只動(dòng)物，間隔至少48 h，并認(rèn)真觀察動(dòng)物。當(dāng)滿足停止實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)之一時(shí)，以圖1為例：①在上限劑量時(shí)，連續(xù)3只動(dòng)物存活；②任意連續(xù)6只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中有5只發(fā)生存活／死亡的轉(zhuǎn)換；③在出現(xiàn)第1次存活／死亡轉(zhuǎn)換后，至少又試驗(yàn)了4只動(dòng)物，自此時(shí)起，對每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行似然比計(jì)算，一旦似然比超過臨界值，停止試驗(yàn)。對于LD50和斜率變化很大的化合物，試驗(yàn)出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)后再進(jìn)行4～6只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物即可滿足停止規(guī)則。在一些情況下，對于劑量—反應(yīng)曲線斜率較小的化學(xué)物質(zhì)，可能需要更多的動(dòng)物（最高試驗(yàn)動(dòng)物總數(shù)為15）。具體終止試驗(yàn)條件，亦可根據(jù)AOT425StatPgm軟件的提示進(jìn)行，停止給藥后，同時(shí)根據(jù)終止時(shí)所用動(dòng)物的狀態(tài)計(jì)算LD50估計(jì)值和可信區(qū)間。

1.4 數(shù)據(jù)處理傳統(tǒng)急性毒性實(shí)驗(yàn)法，依據(jù)每組動(dòng)物死亡數(shù)，采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)方法（Bliss法或改良寇氏法）計(jì)算受試物的LD50及其95%可信區(qū)間。UDP法實(shí)驗(yàn)，將每次染毒劑量及動(dòng)物的結(jié)局輸入AOT425StatPgm程序［2］，計(jì)算LD50和95%可信區(qū)間。

2 結(jié)果

2.1 給藥后一般狀況UDP法試驗(yàn)組與傳統(tǒng)法試驗(yàn)組小鼠，灌胃薄荷油后，大部分動(dòng)物立即出現(xiàn)四處不停走動(dòng)、攀爬、呼吸運(yùn)動(dòng)急促，打動(dòng)等興奮癥狀；30 m in后逐漸安靜，并出現(xiàn)步履蹣跚，行動(dòng)緩慢，左右搖擺，氣息微弱。大多數(shù)小鼠在灌胃后24 h內(nèi)出現(xiàn)異常反應(yīng)；部分有異常反應(yīng)的小鼠可逐漸恢復(fù)正常。對死亡小鼠解剖，肉眼檢查可見小鼠肝臟有不同程度的顏色變深、呈點(diǎn)狀、表面粗糙；胃及腸道呈氣球狀，小鼠腹部明顯膨大。

2.2 UDP法和傳統(tǒng)法薄荷油灌胃動(dòng)物死亡情況和LD50計(jì)算方法UDP法，選擇限度劑量為：2 000 mg／kg；假定LD50：175 mg／kg；級數(shù)因子設(shè)定為（Sigma）：0.5；使用推薦劑量序列（mg／kg）：2 000，550，175，55，17.5，5.5，1.75。而傳統(tǒng)急性毒性試驗(yàn)，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果以及文獻(xiàn)LD50值，等比級數(shù)0.8，設(shè)定給藥劑量，假定一半動(dòng)物組少于半數(shù)死亡，另一半動(dòng)物組多于半數(shù)死亡；但實(shí)際根據(jù)動(dòng)物的死亡情況，并未形成良好的正態(tài)分布，因此選擇改良寇氏法作為統(tǒng)計(jì)方法。具體的動(dòng)物死亡情況、計(jì)算方法和LD50計(jì)算結(jié)果，如表1所示。

表1 UDP法和傳統(tǒng)法急性毒性試驗(yàn)的動(dòng)物結(jié)局和LD50值

將UDP法動(dòng)物結(jié)局，輸入AOT425 StatPam程序，顯示LD50為2 000 mg／kg（798.5～2 150 mg／kg）；傳統(tǒng)法經(jīng)改良寇氏法計(jì)算，LD50為1 589.68 mg／kg （1 405.37～1 798.08 mg／kg）。在動(dòng)物消耗方面，UDP法共消耗16只，傳統(tǒng)法共消耗70只。在時(shí)間消耗方面，UDP法共消耗24 d，傳統(tǒng)法共消耗14 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種方法所計(jì)算的LD50值較為接近，毒性分級相同。對一個(gè)未知受試物進(jìn)行經(jīng)典的傳統(tǒng)急性毒性試驗(yàn)，消耗動(dòng)物量是較大的，一般預(yù)實(shí)驗(yàn)10 ～20只，正式試驗(yàn)40～60只，本次試驗(yàn)耗費(fèi)動(dòng)物70只；使用UDP法，限量試驗(yàn)耗費(fèi)動(dòng)物4只，主試驗(yàn)耗費(fèi)動(dòng)物12只，減少動(dòng)物消耗77.14%。亦可見，UDP法耗時(shí)長于傳統(tǒng)法近1倍，這也表明，在使用UDP法時(shí)，對動(dòng)物質(zhì)量的保障供應(yīng)有一定要求。

3 討論

任何一種藥物或制劑在臨床試用前必須進(jìn)行動(dòng)物毒性實(shí)驗(yàn)，急性毒性實(shí)驗(yàn)是新藥安全性評價(jià)的第一道環(huán)節(jié)。但越來越多的新藥研發(fā)機(jī)構(gòu)和管理當(dāng)局意識(shí)到傳統(tǒng)的急性毒性實(shí)驗(yàn)存在局限性：由于動(dòng)物生理狀態(tài)、周圍環(huán)境等因素的影響，同一種藥物的LD50在不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，往往很難得到一個(gè)穩(wěn)定的數(shù)值［11］。以薄荷油的急性毒性LD50值為例，陳光亮等研究表明，薄荷油灌胃給藥最大耐受量＞4 000 mg／kg，腹腔注射LD50為（1 149.9±78.5）mg／kg［12］。而劉紅杰等則報(bào)道，口服小鼠薄荷油的LD50為3.0 m L／kg［13］，以薄荷油相對密度（0.888～0.908）換算，相當(dāng)于2 694 mg／kg。與本次試驗(yàn)結(jié)果皆有較大差別。由此亦可見，LD50值的計(jì)算受到各種因素影響較多。而人和動(dòng)物對藥物的敏感性差別很大，很難期望使用動(dòng)物的急性毒性試驗(yàn)的結(jié)果來推測對人體的毒性情況［14］。由于LD50測定造成的不必要的動(dòng)物和資源的浪費(fèi)，受到倫理學(xué)界和科學(xué)界越來越廣泛的批評，而采用消耗動(dòng)物較少的急性毒性替代試驗(yàn)將是藥物急性毒性試驗(yàn)的必然趨勢。

本次試驗(yàn)結(jié)果也表明，采用UDP法所獲得的LD50值與傳統(tǒng)法較為接近，使用的動(dòng)物數(shù)遠(yuǎn)少于傳統(tǒng)法所消耗的動(dòng)物數(shù)。給藥后觀察到，口服薄荷油的中毒小鼠表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)毒性作用，這與傳統(tǒng)法以及已有報(bào)道較為一致［12］。由此可見，UDP法是傳統(tǒng)急性毒性試驗(yàn)的一種優(yōu)良替代方法，能夠以最少的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和受試樣品量，與傳統(tǒng)方法一樣得到受試物的LD50值及相應(yīng)的可信區(qū)間；對每只給藥后的動(dòng)物進(jìn)行48 h的密切觀察，并對未死亡的動(dòng)物持續(xù)觀察14 d，能夠提供全面的受試動(dòng)物毒性表現(xiàn)的資料［15］。這符合藥物安全性評價(jià)動(dòng)物急性毒性的實(shí)驗(yàn)要求。因此，UDP法作為急性毒性替代實(shí)驗(yàn)法在新藥研發(fā)和藥品申報(bào)領(lǐng)域具有一定的發(fā)展空間［14，16］。該方法的不足之處在于：由于試驗(yàn)要求分階段進(jìn)行，因此耗時(shí)較長，同時(shí)又要有相同動(dòng)物質(zhì)量供應(yīng)的保障，無法提供量效關(guān)系數(shù)據(jù)，只適于評價(jià)染毒后48 h內(nèi)出現(xiàn)毒性癥狀并死亡的受試品的急性毒性［6，15］

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Experim ental Study on Measurement of Pepperm int Oil LD50 With Up-and-Down Procedure and Traditional Acute Toxicity Testing

ZHANG Fang-zhou，WANG Yi，YAN Wen-jun，et al
（College of Forensic Medicine，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China）

ObjectiveThe peppermint oilwas used as a target object in this experiment.To evaluate the advantage and disadvantage of the up-and-down procedure and the traditional acute toxicity testing.Methods Mice were orally administered with peppermint oil to respectively conduct the up-and-down procedure acute toxicity test and traditional method acute toxicity test，observing the poisoning phenomenon and calculating the median lethal dose（LD50）and 95%confidence intervals.ResultsThe LD50values of peppermint oil from the two methods were 2 000 mg／kg（798.5～2 150 mg／kg）with the up-and-down procedure and 1 589.68 mg／kg（1 405.37～1 798.08 mg／kg）with the traditionalmethod respectively.ConclusionThe LD50values that get from the two methods are similar，and the toxicity grading is equal.This shows that the up-and-down procedure，as an alternativemethod of acute toxicity，has better application value and development prospects in the field of drug safety evaluation.

up-and-down procedure；the traditional acute toxicity testing；median lethal dose（LD50）；pepperm int oil

R965.3

A

1672－688X（2012）04－0268－03

2011年河南科技大學(xué)SRTP項(xiàng)目（2011179）

2012－10－07

河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，河南洛陽471003

張方舟（1989－），男，河南三門峽人，法醫(yī)2009級在校本科生。

呂坪，女，博士，講師，E-mail：lping2008＠163.com