三葉草根際溶磷菌溶磷及分泌IAA能力測定

張 英，朱 穎，姚 拓

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州730070；2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院 草業(yè)科學(xué)系，青海 西寧 810016）

植物根際中存在著大量的能夠溶解磷礦粉的微生物［1－4］。長期以來，國內(nèi)外的學(xué)者對溶磷微生物的種類和能力開展了廣泛的研究［5－11］，取得了一些開拓性成果，但多年的實(shí)踐結(jié)果也表明，溶磷微生物的實(shí)際應(yīng)用效果并不理想，很多菌株在實(shí)驗(yàn)室條件下表現(xiàn)出明顯溶磷能力，但應(yīng)用到田間溶磷效果卻不明顯，難以適應(yīng)不同的生長環(huán)境［12，13］。所以，從特定地區(qū)和植物根際篩選溶磷、適應(yīng)能力強(qiáng)，兼有其他優(yōu)良特性的菌株有著重要的意義。

白三葉（Trifolium repens）和紅三葉（Trifolium pratense）為豆科車軸草屬［14］多年生牧草。紅三葉是優(yōu)質(zhì)的多年生牧草，同時(shí)又是良好的蜜源植物及綠肥植物，是優(yōu)良的園林綠化及水土保持植物資源，植株中富含異黃酮類化合物，具有抗腫瘤（胃癌、乳腺癌），防治骨質(zhì)疏松、改善更年期綜合癥等作用［15］，是一種極有開發(fā)前景的天然藥材，是園林綠化、水土保持和水源涵養(yǎng)地建設(shè)的優(yōu)良草本植物。

目前，有關(guān)車軸草屬植物根際溶磷菌的研究報(bào)道較少。對分離自白三葉和紅三葉草根際的10株溶磷細(xì)菌的溶磷能力和分泌IAA能力進(jìn)行測定，篩選優(yōu)良菌株，為溶磷菌菌株特性的研究和菌肥的開發(fā)利用提供優(yōu)良用菌株資源。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

供試菌株為前期［16－18］在蘭州、定西、酒泉地區(qū)白三葉和紅三葉根際分離、篩選獲得的10株溶磷細(xì)菌（菌株編號為：ls1－3、ls1－5、ls2－11、ls2－12、ls2－16、ls3－1、ls3－2、ls3－5、lhs11、lhs4）。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

LB培養(yǎng)基［19］，PKO 無機(jī)磷培養(yǎng)基［20］，蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基［17］，King培養(yǎng)基［21］，Spot比色液和 S2比色液［22］。

1.3 溶磷能力測定

1.3.1 定性測定 將LB斜面培養(yǎng)基中保存的菌株，活化后點(diǎn)接種于PKO無機(jī)磷和蒙金娜有機(jī)磷平板上，28℃恒溫培養(yǎng)，第10d后觀察、測量各菌株形成的溶磷圈大小。根據(jù)溶磷圈直徑（D）和菌落直徑（d）比值（D/d）初步確定菌株溶磷能力。

1.3.2 定量測定 將50mL液體PKO無機(jī)磷（或蒙金娜有機(jī)磷）培養(yǎng)基裝入150mL三角瓶，121℃滅菌20min，冷卻后，分別將500μL各待測菌株的菌懸液（108cfu/mL）接種至三角瓶中。每菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基（不接種菌株）為對照。將上述三角瓶置于28℃、160r/min搖床培養(yǎng)10d后，用酸度計(jì)測定培養(yǎng)液pH值。將培養(yǎng)液10 000r/min、4℃離心15 min，取上清液，用鉬銻抗比色法測定有效磷增量（扣除對照后的值（mg/L））［23］。

1.4 分泌IAA能力測定

1.4.1 定性測定 將50mL液體King培養(yǎng)基裝于150mL三角瓶，121℃滅菌20min，冷卻后分別將500 μL各待測菌株菌懸液（108cfu/mL）接種至三角瓶中。每菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基（不接種菌株）為對照。將三角瓶置于28℃，129r/min搖床培養(yǎng)12d，取菌株懸浮液50μL滴置于白色陶瓷板上，同時(shí)加50 μL Spot比色液，對照只在比色液中加50μL 10mg/L的植物生長激素（3－吲哚乙酸）；將白色瓷板置室溫下，在15min內(nèi)觀察其顏色變化，顏色變粉紅者表示能分泌IAA，顏色越深表示分泌IAA能力越強(qiáng)；不變色為陰性，即不分泌IAA［22］。

1.4.2 定量測定 取上述培養(yǎng)12d的培養(yǎng)液10 000 r/min、4℃離心10min，取上清液1mL加1mL S2比色液在黑暗下靜置30min，迅速用分光光度計(jì)比色（波長530nm）［22］，標(biāo)準(zhǔn)曲線用純3－吲哚乙酸制作。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 16.0軟件，多重比較采用LSD法。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶磷能力的測定

溶磷圈直徑（D）、菌落生長直徑（d）及比值（D/d）是表征溶磷菌相對溶磷能力的一個(gè)指標(biāo)，可初步確定溶磷菌株的溶磷效果。對各菌株在PKO無機(jī)磷和蒙金娜有機(jī)磷固體培養(yǎng)基培養(yǎng)10d，用溶磷圈法分別測定了各菌株的D/d值（圖1、2），結(jié)果表明，各菌株的D/d值大小差異顯著（P＜0.05）。在PKO無機(jī)磷培養(yǎng)基上，各菌株的D/d值在1.07～1.52，其中，菌株ls1－3的 D/d 值 （1.52）最大，菌 株ls3－2 的 D/d 值（1.07）最小，菌株ls2－11，ls2－16和ls3－2的溶磷透明圈不明顯。在蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基上，各菌株的D/d值在1.00～1.45，其中，菌株lhs1的D/d值（1.45）最大，菌株ls1－3、ls1－5、ls2－11、ls2－13的 D/d值為1，并發(fā)現(xiàn)各菌株無明顯的溶磷透明圈。

圖1 菌株在PKO培養(yǎng)基上的D/dFig.1 D/d vallue in PKO culture medium by phosphate－solub ilizing bacteria

圖1 菌株在蒙金娜培養(yǎng)基上的D/dFig.2 D/d vallue in Mongoli culture medium by phosphate－solub ilizing bacteria

溶磷圈法只能定性測定各菌株溶磷能力。為進(jìn)一步測定各菌株溶磷性強(qiáng)弱，將各菌株單獨(dú)接種于PKO無機(jī)磷和蒙金娜有機(jī)磷液體培養(yǎng)基中10d后測定各上清液有效磷增量，結(jié)果各菌株都具有溶解磷酸三鈣能力（表1），并且差異顯著（P＜0.01）。各菌株在PKO無機(jī)磷培養(yǎng)液中有效磷增量在106.63～666.01 mg/L，其中，菌株ls1－3有效磷增量最大，有效磷增量大于 500mg/L 的菌株有 4 株（ls1－3、1s1－5、ls2－13、lhs4），占溶磷細(xì)菌總數(shù)40%。各菌株在蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)液中的有效磷增量在0.32～58.42mg/L，其中，菌株lhs11有效磷增量（58.42mg/L）最大，菌株lhs4有效磷增量（35.08mg/L）次之，有效磷增量小于3mg/L的菌株有4株（ls2－11、1s2－13、ls2－16、ls3－2），并有2株菌株（ls1－3、1s1－5）不表現(xiàn)溶磷有機(jī)磷的能力。各菌株對不同磷源的分解能力均不同，菌株lhs11既能溶解無機(jī)磷（PKO培養(yǎng)液的有效磷增量為179.11 mg/L），又能溶解有機(jī)磷（蒙金娜培養(yǎng)液的有效磷增量為58.42mg/L），但溶磷的能力差異較大；菌株ls2－13溶解無機(jī)磷（PKO培養(yǎng)液的有效磷增量為593.52 mg/L）的能力較強(qiáng)，但溶解有機(jī)磷（蒙金娜培養(yǎng)液的有效磷增量為0.46mg/L）的能力較弱；菌株ls1－3溶解無機(jī)磷（PKO培養(yǎng)液的有效磷增量為666.01mg/L）的能力很強(qiáng)，但無溶解有機(jī)磷的能力。

表1 各菌株在PKO無機(jī)磷和蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)液中的有效磷增量Table 1 Available phosphorus increased on PKO and MENG Jin－na culture medium

2.2 分泌IAA能力測定

各菌株用King培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)12d，定性和定量測定各菌株IAA的能力，結(jié)果表明，各菌株IAA的能力和數(shù)量差異顯著（P＜0.01）（表2）。測試菌株中7個(gè)菌株具有IAA的能力，占供試菌株數(shù)的70%，分泌量在0.36～20.39mg/L，其中l(wèi)s3－5分泌能力最強(qiáng)，分泌量（20.39μg/mL）也最大。而菌株ls2－16，ls3－2和ls2－11均無分泌IAA的能力。定性測定中，若顯色反應(yīng)顏色越深，說明菌株分泌IAA能力越強(qiáng)，反之越弱；若無顏色反應(yīng)，說明這些菌株沒有分泌IAA能力。為進(jìn)一步確定各菌株分泌IAA的能力，又進(jìn)行了S2法比色定量測定，測定的結(jié)果與定性測定結(jié)果一致。

表2 溶磷菌King培養(yǎng)基中分泌IAA量Table 2 Concentration of IAA secreted by phosphatesolubilizing bacteria in King culture medium

3 討論

植物根際存在很多種溶磷菌，但各菌株的溶磷能力有較大的差異。尹瑞林［24］從土壤中分離出的265株細(xì)菌的溶磷能力平均為每克土壤溶磷2～30mg，其中，巨大芽孢桿菌、節(jié)細(xì)菌、黃桿菌、歐文氏菌及假單胞菌的溶磷能力較強(qiáng)，其次為產(chǎn)堿菌、多黏芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。Sundara等［25］利用磷酸三鈣為磷源，經(jīng)過14d的培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌和埃希氏菌的溶磷能力較強(qiáng)。隨后，Paul和Sundara［26］進(jìn)一步測定從豆科植物根際分離出來的12種芽孢桿菌溶解磷酸三鈣的能力，發(fā)現(xiàn)雖然是相同屬的細(xì)菌，但是Bacillus meaateriu的溶磷能力明顯高于Bacillus brevise。林啟美等［27］測定假單胞菌屬培養(yǎng)7d時(shí)溶磷圈D/d值1.00～3.50；芽孢桿菌屬培養(yǎng)7d溶磷圈的D/d值1.14～1.43；另外，發(fā)現(xiàn)以磷礦粉為唯一磷源培養(yǎng)解磷細(xì)菌，5d后培養(yǎng)液中可溶性磷的含量最高為117.3mg/L。馮瑞章等［28］測定定西苜蓿根際溶磷細(xì)菌菌株Dm84培養(yǎng)8d后，有效磷增量為227.1mg/L。Kobus［29］研究認(rèn)為菌株D/d值的變化不僅與時(shí)間有關(guān)系，還與菌株代謝物種類、釋放快慢及代謝產(chǎn)物在培養(yǎng)基上的蔓延程度等有關(guān)。此次研究測定供試菌株的溶磷能力差異較大，在PKO無機(jī)磷培養(yǎng)基上，各菌株的D/d值在1.07～1.52；在蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基上，各菌株的D/d值在1.00～1.45。各菌株在PKO無機(jī)磷培養(yǎng)液中的有效磷增量在106.63～666.01mg/L，菌株ls1－3有效磷增量最大；各菌株在蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)液中的有效磷增量在0.32～58.42mg/L，其中，菌株lhs11有效磷增量最大。各菌株對不同磷源的分解能力均不同，菌株lhs11既能溶解無機(jī)磷，又能溶解有機(jī)磷，但溶磷的能力差異較大；菌株ls2－13溶解無機(jī)磷的能力較強(qiáng)，但溶解有機(jī)磷的能力較弱；菌株ls1－3溶解無機(jī)磷的能力很強(qiáng)，但無溶解有機(jī)磷的能力。溶磷能力首先取決于菌株本身的特性，另外，菌株的溶磷機(jī)理也非常復(fù)雜［30－32］，如分泌質(zhì)子、有機(jī)酸和其他物質(zhì)的數(shù)量和種類，其次，與難溶性磷酸鹽的結(jié)構(gòu)和組成成分有關(guān)系，本研究各菌株的溶磷機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

植物根際的很多菌株都具有分泌植物生長激素（IAA）能力［33，34］，分泌量差異較大。Malik等［35］用比色法測定了巴基斯坦鹽堿地小麥等植物根際固氮菌株分泌IAA能力，其在5.11～35.70mg/L。本研究各菌株IAA能力進(jìn)行定性和定量測定結(jié)果一致，各菌株分泌IAA量在0.36～20.39mg/L，略低于 Malik的測定結(jié)果。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能與菌株種類、生理和生態(tài)特性及培養(yǎng)條件等因素有關(guān)。比色法只是初步定量研究菌株分泌IAA范圍，若要準(zhǔn)確反映各菌株分泌IAA含量，需進(jìn)一步測定。

［1］林啟美，趙小蓉，孫焱鑫，等.四種不同生態(tài)環(huán)境中解磷細(xì)菌的數(shù)量及種群分布［J］.土壤與環(huán)境，2000，9（1）：34－37.

［2］趙小蓉，林啟美，孫焱鑫，等.小麥根際與非根際解磷細(xì)菌的分布［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2001，16（1）：111－115.

［3］李振東，陳秀蓉，李鵬.紫花針茅內(nèi)生細(xì)菌的分離與鑒定［J］.草原與草坪，2011（1）：8－12.

［4］張曉波，趙艷.結(jié)縷草根際聯(lián)合固氮菌的分離及初步鑒定［J］.草原與草坪，2011（1）：37－41.

［5］陳哲，吳敏娜，秦紅靈，等.土壤微生物溶磷分子機(jī)理研究進(jìn)展［J］.土壤學(xué)報(bào)，2009，46（5）：925－931.

［6］陳春.植物根圍促生菌的研究進(jìn)展及在林業(yè)上的應(yīng)用［J］.山西林業(yè)科技，2010，39（6）：33－37.

［7］康貽軍，程潔，梅麗娟，等.植物根際促生菌的篩選及鑒定［J］.微生物學(xué)報(bào)，2010，50（7）：853－861.

［8］Ahmad F，Ahmad I，Khan M S.Screening of free－living rhizospheric bacteria for their multiple plant growth promoting activities［J］.Microbiological Research，2008，163（2）：173－181.

［9］Karlidag H，Esitken A，Turan M，et al.Effects of root in－oculation of plant growth promoting rhizobacteria （PGPR）on yield，growth and nutrient element contents of leaves of apple［J］.Scientia Horticulturae，2007，114：16－20.

［10］Orhan E，Esitken A，Ercisli S，et al.Effects of plant growth promoting rhizobacteria （PGPR）on yield，growth and nutrient contents in organically growing raspberry［J］.Scientia Horticulturae，2006，110：38－43.

［11］劉青海，姚拓，馬從，等.6株溶磷菌和4株固氮菌混合培養(yǎng)條件的研究［J］.草原與草坪，2011（6）：1－6.

［12］Goldstein A H，Rogers R D，Mesd G.Mining by microbe［J］.Bio－Technol，1993，11：1250－1254.

［13］Gyaneshwar P，Naresh K G，Parekh L I，et al.Role of soil microorganisms in improving P nutrition of plants［J］.Plant and Soil，2002，245：83－93.

［14］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典［M］.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1975：1012－1013.

［15］Peter H M，Ronald B.Isoflavones from red clover（Promensil）significantly reduce menopausal hot flush symptoms compared with placebo［J］.Maturitas，2002，42：187－193.

［16］李玉娥，姚拓，朱穎，等.蘭州地區(qū)苜蓿和紅豆草根際溶磷菌篩選及菌株部分特性研究［J］.中國草地學(xué)報(bào)，2009，31（1）：45－50.

［17］朱穎，姚拓，李玉娥，等.紅三葉根際溶磷菌分離及其溶磷機(jī)制初探［J］.草地學(xué)報(bào)，2009，17（2）：259－263.

［18］朱穎.三葉草根際溶磷特性及其促生效果研究［D］.蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009：5.

［19］李鳳霞，張德罡，姚拓.高寒地區(qū)燕麥根際高效PGPR菌培養(yǎng)條件研究［J］.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，39（3）：316－320.

［20］Hafeez F Y，Malik K A.Manual on Biofertilizer Technology［M］.Pakistan：National Institute for Biotechnology and Genetic Engineering，2000.

［21］姚拓.高寒地區(qū)燕麥根際聯(lián)合固氮菌研究Ⅱ固氮菌的溶磷性和分泌植物生長素特性測定［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2004，13（3）：85－90.

［22］姚拓.飼用燕麥和小麥根際促生菌特性研究及其生物菌肥初步研制［D］.蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002.

［23］Smith K P，Goodman R M.Host variation for interactions with beneficial plant associated microbes［J］.Annal Review of Phytopathology，1999，96：4786－4790.

［24］尹瑞林.我國旱地土壤溶磷微生物［M］.土壤，1988，20（5）：243－246..

［25］Sundara Rao W V B，Sinha M K.Phosphate dissolving microorganisms in the rhizosphere and soil India［J］.Agric Sci，1963，33（4）：272－278.

［26］Paul N B，Sundara Rao W V B.Phosphate－dissolving bacteria in the rhizosphere of some cultivated legumes［J］.Plant and Soil，1971，35：127－132.

［27］林啟美，饒正華，孫焱鑫，等.一株膠質(zhì)芽孢桿菌RGBc13的解磷解鉀作用［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2000，15（4）：116－119.

［28］馮瑞章，姚拓，周萬海，等.溶磷菌和固氮菌溶解磷礦粉時(shí)的互作效應(yīng)［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，26（8）：2764－2769.

［29］Kobus J.The distribution of microorganisms mobilizing phosphorus in different soil［J］.Acta Microbiology of Polish，1962，11：255－264.

［30］趙小蓉，林啟美，李保國.微生物溶解磷礦粉能力與pH及分泌有機(jī)酸的關(guān)系［J］.微生物學(xué)雜志，2003，23（3）：5－7.

［31］王光華，周可琴，金劍.不同碳源對三種溶磷真菌溶解磷礦粉能力的影響［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2004，23（2）：32－36.

［32］葉震，陳秀蓉，楊淑君.東祁連山高寒植被土壤解磷菌篩選及其解磷能力的初步研究［J］.草原與草坪，2010（5）：6－10.

［33］Esitken A，Yildiz H E，Ercisli S，et al.Effects of plant growth promoting bacteria（PGPB）on yield，growth and nutrient contents of organically grown strawberry［J］.Sci Hortic－Amsterdam，2010，124：62－66.

［34］Banchio E，Bogino P C，Zygadlo J，et al.Plant growth promoting rhizobacteria improve growth and essential oil yield inOriganum majoranaL［J］.Biochem Syst Ecol，2008，36：766－771.

［35］Malik K A，Rasul G，Hassan U，et al.Role of N2Fixation and Growth Hormones Producing Bacteria in Improving Growth of Wheat and Rice.In：Proceedings 6th int.Symp.On“Nitrogen Fixation with Nonlegumes”［C］.Ismailia：Egypt，1994：409－422.